Implantación de un injerto vascular de ingeniería tisular en la arteria carótida de ratón mediante la técnica del manguito

Resumen

Aquí, se presenta un protocolo para la implantación de un injerto vascular de ingeniería tisular en la arteria carótida del ratón utilizando la técnica del manguito, proporcionando un modelo animal adecuado para investigar los mecanismos de regeneración del tejido vascular.

Resumen

El desarrollo de injertos vasculares de pequeño diámetro ha sido un esfuerzo global, con numerosos grupos de investigación que han contribuido a este campo. La experimentación con animales desempeña un papel fundamental en la evaluación de la eficacia y la seguridad de los injertos vasculares, especialmente en ausencia de aplicaciones clínicas. En comparación con los modelos animales alternativos, el modelo de implantación de ratones ofrece varias ventajas, como un fondo genético bien definido, un método maduro para la construcción de modelos de enfermedad y un procedimiento quirúrgico sencillo. Sobre la base de estas ventajas, el presente estudio ideó una técnica simple de manguito para la implantación de injertos vasculares de ingeniería tisular en la arteria carótida del ratón. Esta técnica comenzó con la fabricación de injertos vasculares de pequeño diámetro de policaprolactona (PCL) mediante hilatre electrostático, seguido de la siembra de macrófagos en los injertos mediante adsorción por perfusión. Posteriormente, los injertos vasculares de ingeniería tisular celular se trasplantaron a la arteria carótida del ratón utilizando la técnica del manguito para evaluar la permeabilidad y la capacidad regenerativa. Después de 30 días de implantación in vivo , se encontró que la permeabilidad vascular era satisfactoria, con evidencia de regeneración de neotejidos y la formación de una capa endotelial dentro de la luz de los injertos. Todos los datos se analizaron mediante software estadístico y gráfico. Este estudio estableció con éxito un modelo de implante de arteria carótida de ratón que se puede utilizar para explorar las fuentes celulares de la regeneración vascular y los mecanismos de acción de las sustancias activas. Además, proporciona soporte teórico para el desarrollo de nuevos injertos vasculares de pequeño diámetro.

Introducción

La prevalencia y la mortalidad de las enfermedades cardiovasculares están aumentando en todo el mundo, lo que representa un importante problema de salud pública¹. El injerto de bypass vascular es una intervención eficaz para la enfermedad coronaria grave y la enfermedad vascular periférica². El uso de injertos vasculares artificiales con diámetros superiores a 6 mm ha sido bien documentado en entornos clínicos. Por el contrario, aquellos con un diámetro inferior a 6 mm son propensos a la trombosis y a la hiperplasia intimal, lo que puede conllevar un riesgo considerable de reestenosis³. A pesar de los avances significativos en la investigación y el desarrollo de injertos vasculares de pequeño diámetro en los últimos años, con varios productos que se acercan a la aplicación clínica, aún persisten múltiples desafíos ^4,5. Estos incluyen una tasa de permeabilidad a largo plazo relativamente baja, una regeneración vascular limitada y una comprensión insuficiente del mecanismo de regeneración.

La evaluación preclínica de nuevos injertos vasculares de pequeño diámetro se basa en la implantación in vivo en varios modelos animales. Los modelos más utilizados incluyen los modelos de implante de arteria carótida de oveja, arteria femoral de perro, arteria carótida de conejo y arteria abdominal de rata 6,7,8,9. La permeabilidad de los injertos vasculares se puede evaluar en animales de tamaño mediano a grande, como ovejas, cerdos y perros. Sin embargo, estos estudios implican costos sustanciales debido a la experiencia y el equipo requeridos. Además, su complejidad técnica plantea un desafío para la implementación. Por el contrario, los modelos de animales pequeños, como los conejos y las ratas, carecen de especies transgénicas bien establecidas con antecedentes genéticos claramente definidos, lo que representa un obstáculo significativo en el estudio de los mecanismos de regeneración vascular.

En comparación con los modelos animales antes mencionados, el modelo de ratón ofrece un procedimiento quirúrgico relativamente sencillo, una metodología bien establecida para generar ratones modificados genéticamente y un trasfondo genético claramente definido. Sin embargo, el pequeño diámetro de los vasos sanguíneos del ratón hace que la anastomosis de extremo a extremo en el injerto vascular sea técnicamente compleja, ya que requiere una experiencia significativa y produce una tasa de éxito relativamente baja. Para reducir la complejidad del procedimiento y mejorar la tasa de éxito de la implantación de injertos vasculares, el presente estudio empleó la técnica del manguito en un modelo de implante de arteria carótida de ratón.

Tras la implantación in vivo , los injertos vasculares pueden reclutar células endógenas que contribuyen a la regeneración del tejido vascular. La presencia de estas células facilita la endotelización y regeneración de la capa de músculo liso de los injertos. ¹⁰. Sin embargo, la fuente y el tipo de células implicadas en la regeneración del tejido vascular siguen sin estar claros, y se están investigando múltiples teorías que compiten^{entre sí 11}. Entre ellas, la investigación se ha centrado en el papel de las células inflamatorias y madre. Breuer et al. sembraron monocitos derivados de la médula ósea humana (hBMC) en injertos vasculares y descubrieron que las células sembradas reclutaban células huésped en la pared del injerto a través de la liberación de la proteína quimioatrayente de monocitos-1 (MCP-1), promoviendo así la regeneración del tejido vascular¹². En este estudio, se propuso un método eficiente de siembra de células de adsorción por perfusión y se utilizó con éxito para sembrar macrófagos en injertos vasculares de diámetro pequeño de policaprolactona (PCL). Después de la implantación, estas células exhibieron una viabilidad sostenida.

En este artículo se detalla la metodología para la preparación de injertos vasculares de ingeniería tisular y el procedimiento de implantación de la arteria carótida en ratones mediante la técnica del manguito. El proceso comienza con la fabricación de injertos vasculares de pequeño diámetro PCL con parámetros definidos mediante hilatura electrostática. Posteriormente, los injertos considerados aptos para la implantación se someten a pruebas mecánicas. A continuación, los macrófagos se siembran en los injertos vasculares mediante el método de adsorción por perfusión. Finalmente, se implantan injertos vasculares sembrados con macrófagos en la arteria carótida del ratón mediante la técnica del manguito, y se analizan la permeabilidad y las propiedades regenerativas después de un mes de implantación in vivo .

Esta técnica tiene el potencial de mejorar la eficacia y las tasas de éxito del injerto vascular en modelos de ratón. Además, el modelo se puede utilizar para investigar los mecanismos subyacentes a las fuentes celulares, los genes fundamentales y los factores activos en la regeneración vascular, proporcionando apoyo teórico y metodológico para la modificación funcional y el desarrollo de nuevos injertos vasculares de pequeño diámetro.

Protocolo

Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité Ético de Experimentos con Animales del Instituto de Medicina Radiológica de la Academia China de Ciencias Médicas, y cumplieron con las Directrices para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. En este estudio se utilizaron ratones machos C57BL/6, de 6-8 semanas de edad, con un peso corporal de 25-30 g. Los detalles de los reactivos y equipos utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Fabricación de injertos vasculares de pequeño diámetro

NOTA: Fabricar injertos vasculares de PCL de pequeño diámetro utilizando la técnica de electrohilado¹³.

1. Prepare soluciones de PCL al 10%, 15% y 20% (p/v) en hexafluoroisopropanol (HFIP) a temperatura ambiente (RT) durante 12 h.
2. Cargue las soluciones de PCL en una jeringa de 10 ml y coloque la jeringa con una aguja de acero inoxidable de 21 g.
3. Coloque un mandril de acero de tungsteno (0,7 mm de diámetro, 20 cm de longitud) sobre el instrumento de recolección.
4. Fabricación de nueve grupos de injertos vasculares de PCL mediante la técnica de electrohilado. Conecte una fuente de alimentación de alto voltaje a la aguja. Coloque una varilla de acero de tungsteno con un diámetro interior de 0,7 mm a una distancia fija frente a la aguja como dispositivo receptor.
   NOTA: La descripción de los grupos de injertos vasculares se proporciona en la Tabla 1, y los parámetros de los injertos vasculares se detallan en la Tabla 2.
5. Someter los injertos vasculares fabricados a un proceso de evacuación. Colocar los injertos vasculares en un horno de secado al vacío durante 72 h para eliminar los disolventes residuales.
6. Esterilice los injertos sumergiéndolos en alcohol medicinal durante 30 minutos y exponiéndolos a la luz ultravioleta durante la noche.
7. Observar la morfología microscópica de los injertos vasculares utilizando un microscopio electrónico de barrido (SEM). Fije los injertos vasculares a la etapa de muestra SEM con adhesivo conductor y colóquelos en el dispositivo de pulverización catódica de oro para el recubrimiento.
   1. Observar la estructura y morfología de las fibras de los injertos vasculares mediante SEM a una tensión acelerada de 15 kV. Mida el diámetro de la fibra y el tamaño de los poros a partir de imágenes SEM (n = 5) utilizando el software ImageJ.
8. Evaluar las propiedades mecánicas (propiedades de tracción y elasticidad) de los injertos vasculares utilizando una máquina de ensayo de tracción. Pinzar los extremos superior e inferior del injerto vascular con pinzas fijas espaciadas 1 cm.
   1. Estirar el injerto vascular a una velocidad de 10 mm/min hasta la ruptura. Recoja la curva de tensión-deformación de la máquina de prueba de tracción.
   2. Calcule los parámetros mecánicos, incluida la carga máxima (2-15 N), la tensión a la rotura (5-30 MPa), la deformación a la rotura (200%-1500%) y el módulo elástico (1-20 MPa)¹⁴.
9. Realizar análisis estadísticos utilizando software estadístico y de gráficos. Exprese los datos como media ± desviación estándar. Analice y compare las diferencias univariadas entre varios grupos utilizando la prueba post hoc de Tukey en ANOVA de un factor. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001.

2. Siembra de macrófagos en injertos vasculares

NOTA: Asegúrese de que todas las soluciones y materiales sean estériles. Realizar todas las operaciones dentro de la sala de cultivo celular.

1. Cultivo RAW264.7 (macrófago monocitario de ratón) en matraces en condiciones adherentes (Figura 1A). Prepare el medio de cultivo celular utilizando el medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) completo suplementado con un 1% de penicilina-estreptomicina y un 10% de suero fetal bovino. Coloque los matraces en una incubadora a 37 °C que contenga un 5% de dióxido de carbono.
2. Recoja macrófagos con un raspador de células. Deseche el medio con una pipeta de 1 ml y lave las células con PBS.
   1. Añada 2 ml de medio fresco al matraz de cultivo y raspe suavemente la superficie con un raspador de células. Transfiera las células recolectadas a un tubo y centrifugue a 1,000 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Resuspender 5 × 10⁶ células en 100 μL de medio completo.
3. Colocar un injerto vascular de PCL (1 cm de longitud) en un tubo de 15 mL lleno de DMEM y centrifugar a 4.000 x g durante 5 min. Repita este proceso varias veces hasta que el injerto se hunda en el fondo del tubo, asegurando la infiltración completa del material con DMEM.
4. Prepara una placa de Petri de 10 cm forrada con una capa de papel de filtro. Coloque el injerto vascular PCL humedecido sobre el papel de filtro y enróllelo para eliminar el exceso de medio.
5. Tome 10 μL de la suspensión celular con una pipeta de 10 μL e inyéctela en un extremo del injerto vascular. Gire el injerto vascular sobre el papel de filtro para facilitar la distribución uniforme de la suspensión. Inyecte cada extremo cinco veces para un total de diez inyecciones (Figura 1B, C).
6. Colocar el injerto vascular cargado de macrófagos en una placa de 24 pocillos que contenga 1 mL de medio completo e incubar durante 2 h en una incubadora de cultivo celular antes de la implantación.
7. Determine la distribución de las células dentro de la pared del injerto. Incrustar el injerto vascular cargado de macrófagos en un compuesto de tomografía de coherencia óptica (OCT) para la criosección. Teñir los núcleos celulares con 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) y observar bajo un microscopio de fluorescencia.

3. Modelo de implante de arteria carótida de ratón

NOTA: Mantenga un área quirúrgica estéril para procedimientos con animales. Esterilice todos los instrumentos quirúrgicos y desechables antes de la cirugía.

1. Seleccione tres ratones machos C57BL/6 sanos, cada uno con un peso de 25 a 30 g. Ayuna a los ratones el día antes de la cirugía. Implantar un injerto vascular en cada animal, para un total de tres injertos.
2. Construya manguitos a partir de un tubo de nailon (Figura 2A) y presente el diagrama esquemático de la técnica del manguito vascular en la Figura 2B.
3. Anestesiar a los ratones mediante inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico a una concentración de 50 mg/kg (siguiendo protocolos aprobados institucionalmente). Confirme la eficacia de la anestesia asegurando la relajación muscular y la respiración uniforme. Aplique ungüento oftálmico de vaselina en los ojos para prevenir la sequedad durante la anestesia.
4. Coloque el ratón en posición supina sobre la mesa de operaciones y retire el vello del cuello. Esterilizar la zona quirúrgica con yodóforo. Cubra el área no quirúrgica con gasa estéril para mantener un ambiente estéril (Figura 3A).
5. Utilice unas tijeras oftálmicas para hacer una incisión en la línea media (de 1,5 a 2 cm de longitud) desde la mandíbula hasta el esternón. Eleve las glándulas salivales izquierdas y extirpe el músculo cleidomastoideo izquierdo para aumentar el campo de visión quirúrgico. Exponga la arteria carótida común izquierda con micropinzas (Figura 3B).
6. Aislar la arteria carótida izquierda con micropinzas (Figura 3C).
7. Lisea la arteria carótida en dos lugares en la porción media usando una sutura 9-0. Transecte la arteria entre las dos ligaduras con unas microtijeras. Pase el manguito a través de las arterias en cada extremo y asegure la arteria y el manguito con clips arteriales (Figura 3D).
8. Gire la arteria hacia afuera para cubrir el cuerpo del manguito y asegúrela al manguito con una sutura 9-0 con micropinzas (Figura 3E).
9. Implante un injerto vascular entre los dos extremos de la arteria carótida deslizando los extremos del injerto sobre el manguito de la arteria y asegurándolos con suturas 9-0 (Figura 3F).
   NOTA: Los datos dimensionales del manguito, la arteria carótida y el injerto vascular se presentan en la Tabla 3. Aunque los diámetros del injerto y del manguito coinciden estrechamente con los de las arterias carótidas del ratón, existe un desajuste entre el diámetro de la luz anastomótica y el diámetro del injerto. El diámetro de la luz anastomótica se calcula restando el doble del grosor de la pared de la arteria carótida (0,1 mm) del diámetro interno del manguito (0,5 mm), lo que da como resultado un diámetro de la luz de 0,3 mm. El injerto vascular tiene un diámetro interno de 0,7 mm, lo que provoca un desajuste de aproximadamente 2,3 veces (0,7 mm / 0,3 mm = 2,3).
10. Retire las pinzas arteriales en ambos extremos e irrigar el sitio de implantación con solución salina. Evaluar la permeabilidad del injerto vascular mediante la observación de la pulsación arterial distal (Figura 3G).
11. Reposicione la glándula salival izquierda y cierre el sitio quirúrgico con suturas 6-0 (Figura 3H).

4. Cuidados y análisis post-procedimiento

1. Transfiera el ratón a una incubadora a 37 °C y controle continuamente sus signos vitales hasta que recupere la conciencia.
2. Inyectar 5 mg/kg de carbinol para el alivio del dolor postoperatorio.
3. Supervise el ratón durante el período de recuperación y no lo devuelva a la carcasa grupal hasta que se haya recuperado por completo.
4. Anestesiar a los ratones un mes después de la implantación y recolectar las muestras de injerto vascular para su análisis histológico⁹.
5. Realizar la eutanasia mediante asfixia por CO₂ seguida de luxación cervical siguiendo las pautas éticas.

Resultados

Se prepararon con éxito injertos vasculares de pequeño diámetro con diferentes parámetros mediante electrospinning. Las imágenes SEM revelaron que las fibras estaban distribuidas uniformemente y exhibían una disposición irregular dentro de la pared del injerto, con la presencia de estructuras de poros (Figura 4). A medida que aumentaba la concentración de PCL, tanto el diámetro de la fibra como el tamaño de los poros aumentaban. Los valore...

Discusión

El uso de la técnica del manguito para implantar injertos vasculares de ingeniería tisular en la arteria carótida del ratón representa un avance significativo en la investigación cardiovascular¹⁵. Los pasos críticos de esta técnica incluyen la siembra de células y la implantación del injerto. Este estudio empleó un enfoque de adsorción por perfusión para mejorar la densidad de siembra de macrófagos para abordar problemas relacionados con la siembra ce...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% penicillin-streptomycin	Solarbio	P1400
10% fetal bovine serum	Gibco	A5256701
4% paraformaldehyde	Solarbio	P1110
4',6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI)	SouthernBiotech	0100-20
Alcohol	Tianjin Chemical Reaggent Company	1083
Anti-Mouse CD31 primary antibody	BD Bioscience	553370
Arterial clips	RWD Life Science	R31005-06
C57BL/6 mice	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Company
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM)	Gibco	11966025
Electrostatic spinning machine	Yunfan Technology	DP30
Goat anti-rat IgG (Alexa Fluor 555)	Invitrogen	A-21434
Hematoxylin and eosin (H&E)	Solarbio	G1120
Hexafluoroisopropanol (HFIP)	McClean	H811026
Iodophor	LIRCON	V273068
Microscissors	World Precision Instruments	14124
Microtweezers	World Precision Instruments	500338
Normal goat serum	Boster	AR0009
Normal saline	Cisen Pharmaceutical company	H20113369
Nylon tube for cuff	Portex
Optimal cutting temperature compound (OCT)	Sakara	4583
Pentobarbital sodium	Sigma	P3761
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Solarbio	P1003
Poly(ε-caprolactone) (PCL) pellets (Mn = 80,000)	Sigma	704067
RAW264.7 macrophages	Biyuntian Biotechnology
Scanning electron microscope (SEM)	Zeiss	PHENOM-XL-G2
Surgical sutures 6-0	Ningbo Chenghe microapparatus factory	220919
Surgical sutures 9-0	Ningbo Chenghe microapparatus factory	221006
Syringe	Changqiang Medical Devices	0197
Tensile testing machine	Instron	WDW-5D