在高效液相色谱法实验，高压泵从水库通过喷油器采取流动相。然后，它流经反相 C18 填充柱的组分分离。最后，流动相进入检测器细胞，吸光度按 220 nm 和废瓶中的结束。组件从进样口到探测器旅行所花费的时间量称为保留时间。

液相色谱分析法用在这个实验中，分离执行反相柱上的位置。列尺寸是 3 毫米 （身份证） x 100 毫米和白炭黑包装 （3 微米粒子大小） 羧基化填充剂测分配 C18 (ODS)。Rheodyne 6 端口旋转注射阀用于最初存储在一个小的循环中的样品和样品引入移动阶段后，旋转阀。

检测是通过吸收光谱在波长为 220 nm。这个实验可以运行在 254 nm，如果探测器不是变量。从探测器的数据具有模拟电压输出，这衡量使用数字多用表 (DMM)，并且通过与数据采集程序加载计算机读取。由此产生的色谱样品中有一个为每个组件的高峰。对于这个实验，所有三个组件洗脱在 5 分钟以内。

本实验使用一个单一的流动相和泵，称为等度流动相。很难分离的样品，可以用于梯度的流动相。这是当初始流动相是主要是一个水，和随着时间推移，第二有机流动相逐渐添加到整体流动相。随着时间推移，这降低了组件保留次数和工作方式类似于温度梯度对气相色谱仪，此方法引发此相的极性。有某些情况下，列加热 （通常到 40 ° C)，其中带走任何保留时间与环境温度的变化相关的错误。

在反相高效液相色谱法，列固定相填料通常 C4，C8 或 C18 填料。C4 列是主要为大分子量的蛋白质，而 C18 柱是肽和低分子量的基本示例。

吸收光谱法检测是选择的压倒性的检测方法，吸收光谱的组件都是选择的唾手可得的。一些系统使用电化学测量，如电导率或碳纤，作为他们的检测方法。

对于这个实验，流动相是主要 20%乙腈和 80%纯化 (DI) 去离子的水。加少量的醋酸降低流动相，硅在固定包装阶段保持不离州的 ph 值。这减少了吸附峰从尾矿，给窄峰。然后，ph 值被调整与 40%氢氧化钠提高 ph 值，帮助减少组分的保留时间。

每个组使用一套 7 小瓶含有不同浓度的标准溶液 (表 1)。第一 3 用于标识每个峰，和最后的 4 个用于创建为每个组件的校准图表。标准 1-3 还用于校准图表。

表 1。用于准备 7 提供的工作标准 （每一个标准的总容量是 50 毫升） 的股票标准卷。

采用高效液相色谱是能够量化的每个基于标准 (图 3) 的校准曲线的所有样本的 3 组件。

从这套实验，它确定这些减肥苏打水 12 盎司可以载支付下列金额，每个组件：

健怡可乐： 50.5 毫克咖啡因;阿斯巴甜 217.6 毫克;83.6 毫克苯甲酸。
零度可乐： 43.1 毫克咖啡因;阿斯巴甜 124.9 毫克;85.3 毫克苯甲酸。
百事轻怡： 34.1 毫克咖啡因;阿斯巴甜 184.7 毫克;79.5 毫克苯甲酸。

不足为奇的是，所有 3 约有同样数量的苯甲酸酯，因为它是只是一种防腐剂。焦炭产品有更多的咖啡因，和零度可乐已经少得多阿斯巴甜比其他两个的苏打水，因为它也包括柠檬酸为一些调味料。

下面的编号是实际大量咖啡因和阿斯巴甜在 12 盎司罐头的 3 种饮食苏打水 （咖啡因含量制得的可口可乐和百事可乐的网站。阿斯巴甜内容被从网上和 DiabetesSelfManagement.com）：。

健怡可乐： 46 毫克咖啡因;阿斯巴甜 187.5 毫克
零度可乐： 34 毫克咖啡因;阿斯巴甜 87.0 毫克
百事轻怡： 35 毫克咖啡因;阿斯巴甜 177.0 毫克

计算示例 (表 2):

浓度的咖啡因在 STD #1： 咖啡因的组件解决方案有 0.400 g 的咖啡因稀释至 500 毫升 = 0.500 L → 0.800 g/L = 0.800 毫克/毫升。

STD #1 有 1 毫升的稀释至 50.0 mL 此解决方案
0.800 毫克/毫升 * (1.0 毫升/50.0 mL) = 0.016 毫克/毫升 = 16.0 毫克/升。

STD #2 了 2 毫升的稀释至 50.0 mL 此解决方案
0.800 毫克/毫升 * (2.0 毫升/50.0 mL) = 0.032 毫克/毫升 = 32.0 毫克/升。

从三个校准图 (图 4) 结果产生了以下等式：

咖啡因峰面积 = 0.1583* [咖啡因 mg/L]-0.574
阿斯巴甜峰面积 = 0.02696* [阿斯巴甜 mg/L]-0.405
苯甲酸峰面积 = 0.1363* [苯甲酸 mg/L]-1.192

健怡可乐： 咖啡因峰面积 = 10.68 = 0.1583* [咖啡因 mg/L]-0.574

[咖啡因 mg/L] = (10.68 + 0.574) / (0.1583) = 注入样品中 71.1 毫克/升。

自从 2 倍稀释，健怡可乐了 141.2 mg/L 咖啡因。

每个 12 盎司的金额可以 = (141.2 毫克/升) (0.3549 毫升/12 盎司 can) = 50.5 毫克咖啡因 / 可以。

图 3。高效液相色谱-5 标准和 3 个样品。

图 4。每个 3 组件校准曲线。

表 2。用于生成校准曲线的高效液相色谱法试验数据表格。

高效液相色谱法是一种广泛用于技术在分离和检测对于许多应用程序。它是理想的非挥发性化合物，作为气相色谱 (GC) 要求，样品都放在他们的气相。非挥发性化合物包括糖、 维生素、 药物，以及代谢物。它也非破坏性的它允许每个组件必须收集为进一步分析 （例如质谱）。流动相是几乎是无限的它允许对极性的 ph 值，以实现更高的分辨率的更改。在实际试验中的梯度流动相使用允许这些变化。

对可能与人工甜味剂阿斯巴甜的可能的健康问题甚表关注。当前产品标签不显示这些组件在饮食饮料的量。此方法允许为量化这些款额及咖啡因和苯甲酸。

其他应用程序包括确定数额的农药在水中;确定所用的对乙酰氨基酚或布洛芬在疼痛缓解片;确定是否有提高成绩的药物存在于血液中的运动员;或简单地确定毒品犯罪实验室中的存在。虽然这些样品的浓度和经常身份的组件，可以很容易确定，一个限制是，几个样本可能会接近相同的保留时间，从而导致共同洗脱。