1.使标准： 系列稀释

1. 让股票浓缩液的标准。通常情况下，该化合物是准确称出并定量地转移到容量瓶内。添加一些溶剂、 混合使样品溶解，然后填充到行用适当的溶剂。
2. 执行系列稀释。采取另一容量瓶和移液器的标准所需的稀释量然后填充到行用溶剂和混合。十倍稀释通常做，因此为 10 毫升的容量瓶，加 1 毫升的以前的稀释。
3. 继续根据需要为更多的稀释，用移液器从以前液稀释，使下一个样品。好的校准曲线，需要至少 5 浓度。

2.运行样品校准曲线和未知

1. 紫外-可见分光光度法测定，以确定所需的校准曲线的仪器响应运行这些示例。
2. 采取了阅读与第一个示例。它是一个好的主意，要运行这些示例以随机的顺序 （即不最高到最低或最低到最高），以防有任何系统性的错误。为了得到噪声估计，重复对任何给定的样本阅读 3 — — 5 倍。
3. 运行附加的标准样品，重复测量得到的噪声估计每个样品。记录的数据，后来使情节。
4. 运行未知的样品。用作对运行标准尽可能类似的条件。因此，样本矩阵或缓冲区应该是相同的 ph 值应该是一样的和浓度应在标准范围内运行。

3.制作校准曲线

1. 电子表格中记录数据，并使用计算机程序来绘制数据 vs 浓度。如果每个点至少一式三份的测量，误差线可以绘制那些测量值的每个点的误差估计的标准偏差。对于一些曲线，数据可能需要绘制轴为日志以获取一条线。方程的校准曲线是众所周知的时间，所以对数图使用时有方程中的日志。
2. 检查校准曲线。它看线性？有没有看起来的非线性部分 （即达到的仪器响应限制）？若要检查，适合对线性回归使用软件的所有数据。如果系数的测定 (R²) 不是高的删除一些不似乎拟合线和执行线性回归再次指向的开始或结束的曲线。它是不能接受删除点在中间，只是因为他们有一条较大的误差。从这一分析，决定曲线的哪一部分是线性的。
3. 线性输出应该是方程格式 y = mx + b，其中 m 是斜率，b 是 y 轴截距。边坡的单位是 y 轴单位/浓度，在这个示例 (图 1) 吸光度/μ M。Y 轴截距的单位是 y 轴单位。测定 (R²) 系数。越高 R²适合;一个完美的结合给 1 R² 。该程序可能也能够给上斜率和截距的错误估计。

4.结果： 校准曲线的吸光度的蓝色染料 #1

1. #1 蓝染料的吸光度的校准曲线 (在 631 nm) 如下所示 (图 1)。响应是线性从 0 到 10 微米以上，浓度信号渐趋平稳因为响应是从紫外-可见分光光度计的线性范围。
2. 计算 LOD。从校准曲线的斜率，LOD 是 / m。 3*S.D。 （噪音）为此校准曲线，噪声得到考虑的重复测量的标准偏差，0.021。LOD 将 3*0.021/.109=0.58 µ M。
3. 计算 LOQ.LOQ 是 / m。 10*S.D。 （噪音）为此校准曲线，LOQ 是 10*0.021/.109 = 1.93 µ M。
4. 计算未知的浓度。使用直线方程来计算未知样品的浓度。校准曲线的有效期只当未知落入标准样品的线性范围。如果读数过高，稀释可能有必要。在此示例中，未知的运动饮料是稀释的 1:1。吸光度 0.243，这对应了 2.02 µ M 浓度。因此最后染料浓度、 蓝色 #1 在运动中喝了 4.04 µ M。

图 1。紫外-可见吸收的蓝色染料的校准曲线。左：吸光度测定不同浓度的蓝色染料 #1。响应级别后 10 µ M，吸光度时超过 1。误差线是从同一样品的重复测量和标准偏差。权：校准曲线的线性部分符合一条线，y = 0.109 * x + 0.0286。未知的数据所示黑。请点击这里查看此图的大版本。