这种方法可以帮助我们回答与基因表达相关的关键问题，向我们展示染色质结构如何影响基因表达，以及染色质组织如何调节转录动力学。我们开发这项技术是因为我们希望能够控制地改变染色体结构，以创建远程染色质循环。同时具有逆转染色质上下文的能力，以恢复内源染色体结构。
该方法旨在便于使用和广泛适用。我们利用了无毒的二丁车以及dcas9的正交品种，以便更广泛地使用该系统。我们开发这种方法是因为我们希望能够回答长期以来的问题，即基因表达是否产生染色体结构，或者染色体结构是否导致基因表达的变化。
文本协议描述了CRISPR引导RNA序列的设计以及细胞培养物的维护。质粒图和利用的底片列在下面。通过将5微克的扁病毒CRISPR质粒与3微升的BsmB1三微升碱性磷酸酶6微升10倍消化缓冲液和0.6微升新鲜制备的100毫摩尔DTT混合开始质粒制备。
将总体积达到60微升的双蒸馏水，并在37摄氏度下孵育混合物30分钟，以消化和脱磷质粒。然后，凝胶净化循环质粒和双蒸馏水中的消化质粒。接下来，为引导RNA对准备退火反应。
将每个导导RNA的一微升与10x T4结扎缓冲液1微升、双蒸馏水和0.5微升T4 PNK混合，总反应量为10微升。将引导RNA对退到目标序列中，在30分钟内在37摄氏度下孵育混合物，然后在95摄氏度下孵育5分钟，然后通过每分钟降低5摄氏度来逐渐将温度降至25摄氏度。接下来，在双蒸馏水中将退火导 RNA 稀释在一到两百。
现在，准备两个结扎反应。将消化质粒的一微升与稀释的膜内导轨 RNAse 2.5 微升 2x 结扎缓冲液混合 1 微升双蒸馏水和 0.5 微升的连结酶。在室温下孵育反应10分钟，将导轨BsmB1消化质粒吸收。
然后将新连接质粒转化为稳定的三种细菌，并使用任何质粒制备方法放大细菌。在六井板上，每井，种子75万2n3Tcell在DMEM与10%FBS和1%笔链球菌。每个构造使用一个井，并孵育细胞24小时。
第二天，将介质更改为新鲜抗生素无 DMEM，使用 10%FBS。在改变每一个镀细胞井的介质后，准备一管伦蒂病毒生产混合物。每次反应，用150微升的Opli-MEM介质稀释11微升脂基转染试剂。
然后在单独的管中准备DNA。将CLOud9扁病毒载体质粒的两微克与其他扁病毒包装成分的两微克混合。在 Opti-MEM 介质的 150 微升中稀释这种混合物。
然后将稀释的扁病毒质粒混合物的等量混合在稀释的脂质转染试剂中，并在室温下孵育混合物五分钟。然后在每个细胞井中加入一管准备好的混合物，继续孵育。48小时后，将病毒生产介质从板井转移到锥形中，并在300克下旋转5分钟。
然后将上流液转移到新鲜管中，以丢弃颗粒碎屑。现在，立即使用病毒生产介质对目标细胞进行转导，或在80摄氏度下冷冻，供将来使用。首先添加250微升的每个病毒结构感兴趣，在这种情况下，由补充CLOud9质粒到50毫升锥形管包含8万个细胞。
然后加入足够的聚布雷恩，使溶液中每毫升1至8微克之间。然后使用无抗生素介质将每个管的总体积调整为一毫升。现在增加病毒颗粒和细胞之间的接触，在室温下以800克旋转细胞30分钟。
然后通过移液将上流器的细胞重新挂起。接下来，将细胞的悬浮液加载到培养盘上，并孵育24小时。第二天，收集单元格。
在室温下以300克离心5分钟，并在正常介质中重新悬浮。第二天，在介质中加入紫霉素和湿霉素，以选择双转导细胞。应提前确定每种细胞类型的抗生素的适当浓度。
然后，在选择介质中孵育细胞至少三天，然后继续下游应用，并继续维护细胞和选择介质。要使CLOud9选定和转导的细胞变暗，在培养皿中加入一毫摩尔BA。对于控件，添加 DMSO，然后在实验期间使用 ABA 或 DMSO 维护单元格。
要扭转二丁二白，请用足够的 PBS 清洗电池以覆盖板表面两次。此后，无 ABA 介质中的培养细胞将它们保持无分位状态。适当使用 CLOud9 系统会通过向细胞培养基培养基添加或删除 ABA 来促进互补的 CSA 和 CSP CLOud9 构造的可逆接触。
使用标准CRISPR指南RNAAse，将CSA和CSP构造本地化为适当的基因组区域。利用染色质免疫沉淀和定量PCR，确保每个CLOud9成分的准确定位。此外，有或没有 ABA 的共性沉淀在配体存在的情况下验证了 CSA 和 CSP 二化，在配体不存在的情况下具有可逆性。
ABA二度化后，通过染色体确认捕获测量β-球蛋白与LCR之间的更大接触。但是，在仅包含 CSA 或仅包含 CSP 构造的控件中未观察到此情况。创建 LCRβ-球蛋白相互作用并不能完全消除内源性 LCR 球蛋白接触。
它只添加到原始联系人。无论目标 LCR 或 β-球蛋白促进剂区域内的确切区域如何，通过 72 小时的二丁化观察到 β-球蛋白 LCR 接触的增加。最后，在去除BA后，通过染色体确认捕获确认了系统的可逆性。
这导致了内源确认的完全更新。在尝试此过程时，重要的是要记住每天更换介质并添加新的二暗化 CLOud9 转导细胞。不要忘了使用扁病毒可能非常危险，执行此过程时应始终采取在 BSL 2 中使用的所有预防措施。
