尿嘧啶-DNA糖基化酶测定，采用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱分析

DNA修复机制对于维持所有生物体的基因组完整性非常重要。尿嘧啶-DNA糖基化酶是基本组织修复途径中至关重要的DNA修复蛋白。使用MALDI-TOF质谱法，我们可以直接检测AP产物用于酶活性测定。

传统的糖基化酶测定需要底物劳动。该方法无需标记，可直接检测从尿嘧啶底物到AP产物的质量变化。其他优点包括高特异性、多功能性、可扩展性、快速性和易于执行。

我们以大肠杆菌尿嘧啶-DNA糖基化酶为例。该方法可以很容易地被修改用于其他DNA糖基化酶测定。训练有素的实验室人员具有准确的移液和稀释技能至关重要。

应使用新鲜制备的试剂和低盐缓冲液，以获得更好的信号和更小的背景噪声。演示该程序的将是来自我实验室的博士生Hui-Lan Chang。对于使用T1 U + 9双链鸟嘌呤 - 尿嘧啶碱基底物的DNA糖基化酶测定，在1.5毫升无菌微量离心管中加入70微升水，10微升10X尿嘧啶 - DNA糖基化酶或UDG反应缓冲液，5微升T1储备和5微升U + 9储备。

关闭管子，然后在65摄氏度的水浴中孵育30分钟，然后在37摄氏度下孵育30分钟，最后在冰上三分钟，以确保基板模板双相正确退火。接下来，在新的1.5毫升管中，加入49微升冰冷的UDG反应缓冲液和一微升稀释的UDG，然后用UDG缓冲液制备连续稀释液以获得所需的酶浓度，并将稀释的UDG放在冰上。接下来，在另一个1.5毫升的管中，加入9微升制备的底物混合物，并在37摄氏度下预热，然后加入一微升稀释的UDG并轻拂管以混合内容物。

短暂离心反应混合物并立即将管置于37摄氏度下孵育。使用计时器对反应进行计时。为了终止反应，制备0.25摩尔盐酸和0.23摩尔三碱溶液。

在制备试剂时，使用pH计确认pH值，并在操作反应终止步骤之前通过pH条进行测试，然后用一微升0.25摩尔盐酸化10微升tris-EDTA，并确保pH值约为2正负0.5。用一微升tris碱中和溶液，并确保最终pH值约为6.5正负0.5。接下来，向反应混合物中加入一微升0.25摩尔盐酸以灭活酶并将管放在冰上六分钟，然后加入一微升tris碱以中和DNA产物并避免AP位点因长时间暴露于酸而破裂。

加入13微升tris-EDTA以增加用于基质芯片转移的产物混合物的体积后，将管放在冰上。最后，将所有25微升UDG反应产物从微量离心管转移到384孔微量滴定板中。打开纳升分配器的门，将384孔微量滴定板加载到甲板的板架上，然后将基质芯片阵列插入相应的侦察板位置。

将装载的侦察板放在纳升分配器的处理甲板上，然后关闭门。触摸转印屏幕上的运行按钮，等待仪器开始将样品从微量滴定板分配到基质芯片。接下来，使用视觉选项卡选项，在点胶过程中显示芯片的图像和每个点的点胶量。

确保芯片上的斑点体积在5到10纳升的范围内。使用适当的应用程序，准备一个包含预测信号 M x Z 值的 xlsx 文件以进行导入。然后使用应用程序创建和定义新的UDG测定，方法是右键单击设计器格式的导入测定组选项，并从下拉列表中选择Excel文件。

接下来，右键单击客户项目板按钮，然后单击下拉选项树的顶部以建立新的测定板。然后在对话框中，键入文件名。在板类型下拉列表中，选择384孔板类型。

按确定，然后等待屏幕右侧出现空白板。接下来，单击检测选项，然后从下拉列表中选择检测方法。要将所选检测方法分配给板上的每个样品点位置，请将光标移动到空白板的每个位置，单击以突出显示孔，然后单击以选择添加斑块。

使用台式机或笔记本电脑，为芯片上的所有样本准备xlsx格式的工作列表，没有标题，然后单击添加新的示例项目按钮并从下拉列表中选择文件以导入工作列表。在屏幕左侧的工作列表中查找所有测试示例代码，然后单击工作列表中的示例代码并右键单击板的相应位置以将测试链接到每个位置。按下质谱仪的输入/输出按钮以扩展甲板并取出芯片支架。

将样品芯片插入芯片支架，将装载的芯片支架放在扩展的甲板上，然后再次按下输入/输出按钮，以便样品芯片进入仪器。在质谱仪控制程序中，双击采集图标。在采集窗口中，单击自动运行选项卡以启动仪器并从芯片上的样品中获取质谱。

对于数据分析，请运行数据分析程序，然后浏览数据库树并选择芯片ID。单击以突出显示芯片上的目标井，然后单击光谱图标以显示质谱。右键单击以选择自定义对话框并在新窗口中裁剪特定频谱范围，然后单击x轴以键入M x Z的上限和下限，然后按OK显示指定范围的频谱，包括感兴趣的信号。要测量信号M的峰值高度，Z值对应于尿嘧啶底物，AP积和模板，请单击峰值并在屏幕左上角查看峰值高度。

最后，要保存频谱以进行记录保存，请右键单击导出并在下拉列表中选择文件类型为JPEG。单击目标并浏览磁盘以在下拉列表中选择存储设备，然后键入文件名并单击导出。此处显示了用于 DNA 糖基化酶测定的模型系统。

19个核苷酸模板DNA在糖基化酶水解后保持不变。因此，该信号可以作为AP产品定量的参考。底物和相应模板之间一个核苷酸的差异为两者产生了一个分离良好的信号曲线。

AP产物的信号也与含尿嘧啶的底物的信号很好地分离。对于MS数据分析，测量了峰高。UDG 活性在 0.01、0.02、0.05 和 0.1 的时间过程分析表明剂量和时间依赖性。

这里显示了产物和底物在纳摩尔浓度下具有相对MS信号强度的反应速率图的示例。UDG反应速率表示为每秒产生的AP位点的纳摩尔。KM 和 VMAX 是根据 Lineweaver Burk 图计算得出的。

MALDI-TOF质谱测量单位与定义的单位成正比，从0.001单位到0.02单位，具有可观的测定系数。这里显示了尿嘧啶糖基化酶抑制剂对UDG活性的抑制。在存在100皮摩尔的抑制剂时，0.05单位的UDG的活性被抑制到检测不到的水平，并且发现IC50为7.6皮摩尔。

由于 AP 大小不稳定，可在极端 pH 值和高温下通过 β 消除反应水解，因此应在规定的时间段内在冰上进行测定淬灭。此外，使用pH计确保HCL将反应缓冲液酸化至所需的pH值，并且tris碱正确中和产物混合物。该方法也可以被修改以分析双功能DNA糖基化酶。

例如，U + 2 T3是甲酰胺基嘧啶DNA糖基化酶测定的合适底物。FPG AP连接酶活性的裂解产物可以很容易地被MALDI-TOF质量检测到。该方法有可能成为单官能糖基化酶测量的参考方法，也可以用作药物开发中糖基化酶抑制剂筛选的工具。