该协议生成单个人类小岛细胞的高通量转录数据，可用于研究异质性、识别罕见细胞类型和疾病中的基因调控。该技术可生成较大规模的单细胞数据，易于使用，处理时间相当短。此方法可应用于来自其他物种的小岛，并用于剖面其他新鲜分离的组织。
然而，协议需要优化，以适应组织特定的分离程序。准备高质量的分离细胞至关重要。单细胞分治前的细胞悬浮液的QC是关键，就像小心和快速处理乳液一样。
一些质量检查点，如知道芯片是否堵塞，比阅读更好看。在获得人类小岛并孵育过夜后，使用P200移液器计数并精心挑选200至300个小岛。将小岛转移到一个15毫米的圆锥管中，该管包含5毫米的完整小岛介质，预热至37摄氏度。
将管以 200 次 G 将离心机中放置两分钟。轻轻吸气上清液，而不干扰底部的颗粒。加入一毫米预热细胞分离溶液，通过上下轻轻移液来破坏颗粒。
在37摄氏度下孵育小岛9至11分钟。每三分钟，移液器缓慢向上和向下10秒分离细胞到单个细胞。一旦小岛细胞分离良好，溶液变得浑浊，加入9毫升的完整小岛介质，并通过30微米细胞滤株过滤到一个新的15毫升锥形管中。
在400次G下离心收集细胞5分钟。在 1X PBS 04%BSA 溶液的 200 至 300 微升中吸升，重新悬浮细胞颗粒。现在，将细胞培养的10微升与0.5微升的O/DAPI混合。
上下移液，彻底混合。将 10.5 微升加载到幻灯片上，并在基于荧光的自动细胞计数器上运行细胞计数测定，以确定计数和可行性。将微流体芯片放入芯片盒中。
定位芯片箱，确保油井最接近进行实验的人。使用移液器将计算的细胞体积添加到准备好的管条中。移液器混合五次。
在不丢弃移液器尖端的情况下，将 90 微升的电池混合物转移到一个芯片上。等待30秒，然后移液器非常缓慢地加载40微升凝胶珠排第二。向第三排的油井分配 270 微升的分区油。
将芯片垫片连接到芯片支架的卡舌上。将组装的芯片支架放入单单元分区装置中，然后按下运行按钮。运行完成后，从支架上拆下芯片垫片，以 45 度角打开芯片外壳，并从芯片中转移 100 微升乳液，放入蓝色塑料 65 井板中的井中。
将 125 微升粉红色乳液分解试剂分配到每个乳液中。等待一分钟，然后将每井的整个体积转移到每根 0.2 毫升管中。确保管条中有一层透明和一层粉红色。
使用移液器，从管条底部取出 125 微升的粉红色层，而不会干扰透明层。粉红色层约15微升的小体积留在管子中是正常的。然后在每个管条中加入200微升的清洁混合物，并在室温下孵育10分钟。
将管条转移到磁性支架上，等待两分钟，让溶液清除。拆下上一液并丢弃。然后用80%乙醇洗珠两次。
让珠子干燥一分钟。从磁铁上取下管条，向珠子中加入 35.5 微升洗脱溶液。移液器在溶液中重新悬浮珠子，并在室温下孵育两分钟。
将管条转移到磁性支架上，使溶液清除。将净化的互补DNA从管条中转移至清洁0.2毫升管条。为了放大互补DNA，首先在每个样品中加入65微升的互补DNA扩增母体混合物。
将管条放在热循环器中，然后根据手稿运行程序。样品可以在4摄氏度下储存长达72小时。将补充DNA正常化为15个语法和20微升后，将30微升的标记混合到冰上每个互补DNA样本中。
将样品放入热循环器中，在 55 摄氏度下运行标记协议 5 分钟，降至 10 摄氏度并保持。然后将60微升样品指数PCR主混合和10微升20微摩尔甲醇样品指数添加到30微升纯化补充DNA样本中。将管子返回到热循环器中，以放大最终库产品。
将每个样品与水一起标准化至每微升两毫克，并在1.5毫升管中将每个标准化样品的三微升一起拉取。将带洗脱缓冲液的稀释池稀释至每微升0.25纳米。通过结合12微升稀释池样品、一个动物或DNA对照的1微升、2个洗脱缓冲液微升和5个0.4普通氢氧化钠的微升来使池化。
孵育混合物5分钟，然后在pH8下加入10微升200毫摩尔三酯，将混合物的4.05微升装入1345.95微升HTA-1。接下来，将 1.3 毫升装入音序器的墨盒中，然后按照制造商的指南使用测序配方运行。在计算机上，运行 Cell Ranger 以将通过排序生成到 FASTQ 文件生成的原始基本调用文件去多路复用。
将 FASTQ 文件与人类 b37.3 基因组组装对齐，并使用 CSC 基因模型获得表达定量。检查条形码排名图，以确保与单元格关联的条形码和背景的分离。为了控制细胞质量，排除检测到基因少于500个、唯一分子标识符总数少于3000个且大于0.2个生存能力评分的细胞。
根据组织和细胞类型调整切口。接下来，使用R包mclust去除表达多个激素基因的细胞。使用R包seurat通过总唯一分子标识符使基因表达正常化，并在细胞水平上乘以10，000的尺度因子。
然后使用所有细胞的平均表达和分散来检测可变基因。根据组织和细胞类型调整截止。使用可变基因执行主要成分分析。
具有选定数量的主要组件的群集单元格。通过比较一个细胞簇与其他细胞，获得细胞聚类丰富的基因。在这个单细胞RNA测序协议中，获得的人小岛首先在RNA荧光和C2杂交中通过α和β细胞进行分离。
分区步骤后乳液的成功示例显示，从凝胶珠分离的分区油具有最小的隔断油，均匀的苍白、多云溶液。相比之下，凝胶珠和油之间分离清晰的劣质乳液可能是由于芯片运行过程中堵塞造成的。在补充DNA扩增后，一个具有代表性的片段大小的分布显示，一个高质量的补充DNA样本的典型峰值位于近1000至2000个碱基对。
近600个碱基对的峰值是小岛互补DNA特异性的。RNA测序库的片段大小分布在300到500个碱基对之间。聚类分析揭示了T分布式随机邻域嵌入尺寸空间中的12种单元格类型。
在α细胞和4个β细胞中揭示了三个亚群。这项技术使研究人员能够为人类小岛建造一个综合性的细胞小岛。随着来自非糖尿病和糖尿病捐赠者的更多数据，它用于治疗靶点发现的资源。
