高通量硝基苯并二氮唑标记的胆固醇积液测定

该协议是我们在脑血浆中胆固醇回流的胆固醇终止的基于细胞的方法。特别是在筛选中。这可能用于诊断心血管风险，并识别或评估胆固醇降低维持。

该技术避免了风险和负担，因为安全处理辐射材料提供的结果具有可比的质量水平，胆固醇回流已报告与胆固醇回流关联，因此，血浆或陶瓷胆固醇回流的接受可以比较，我们的参考控制，并可能提供风险遭受这种方法也将应用于细胞系，像其他人类细胞系，甚至主要宏相。宏相或和人类诱导喷雾按钮干细胞。为了开始这个程序，在纯乙醇中溶解NPD胆固醇，以获得最终浓度为2微摩尔的库存溶液。

稀释AR10介质中25微升的NBD胆固醇库存，最终浓度达到5微摩尔。培养thp-1细胞在我们的10个介质在37摄氏度与5%的二氧化碳。每三天将细胞密度调整为每毫升30万个细胞。

然后获得一个96井板与平坦的透明底部。为了更好的均质化，在15毫升管中准备10毫升的thp-1细胞，并加入200微升的PMA库存。轻轻地将混合物的100微升混合到板井中，每孔有20万个细胞。

在37摄氏度下孵育5%的二氧化碳48至72小时，将thp-1细胞分化成DM thp-1细胞。首先用无菌水稀释10%PBS中的甘氨酸，浓度为200微摩尔，浓度为pH7.4。将40毫升稀释的甘氨酸加入10克钉8000，以准备20%的钉溶液，并大力混合以均质化。

接下来，在1.5ml管中，将四个部分（每10个样本的20%）涂抹到每个血清或血浆样品中。将混合物留在冰上25分钟。离心钉脂蛋白B沉淀在13000倍G，并在4摄氏度15分钟。

丢弃沉淀物，将上看液转移到新管中。检索包含分化 thp-1 细胞的板。取出并丢弃培养介质，然后用 1X PBS 清洗两次细胞。

在每个井中加入100微升5微摩尔MVD胆固醇。在37摄氏度下孵育，二氧化碳含量为5%。第二天丢弃，丢弃介质。

用 PBS 清洗细胞两次，然后加入 100 微升 ABDS，或纯脂接受物在 rpmi 1630 介质中稀释，以达到所需的浓度。包括一个阴性控制，其中不包含胆固醇接受器在阳性控制，如文本协议中概述，并在37摄氏度孵育4至6小时。同时，准备200毫升的细胞解解溶液，如文本中所述。

将该溶液与乙醇混合，体积比为一比，获得解液。对于介质和BD胆固醇检测，从收集到的新的白色96孔板中收集的细胞介质中去除细胞介质，其底部不透明。在每个介质样品的100微升中加入100微升纯乙醇，获得新板材的一对一比例。

使用光照计，测量荧光灯的强度在463纳米的激发和536纳米的发射。对于细胞内NBD胆固醇检测，用PBS清洗细胞两次。将100微升的解液也加入到每井中，并在室温下孵育，同时摇晃25分钟。

在此之后，测量荧光的强度，同时在软件中将灵敏度参数调整为 50。然后确定文本协议中概述的胆固醇出血的最终测量中的胆固醇出血率。在纯乙醇中稀释NBD胆固醇会产生最高的荧光强度值，而水溶液中的高含量则会降低强度。

这表明，荧光的这种分子的发射高度依赖于介质，其中含有它。当以一比一的比例使用介质和乙醇的混合物时，荧光的强度似乎按比例增加，胆固醇的浓度与胆固醇类似，这表明探针在这些条件下行为得当。为了确定用胆固醇接受器孵育加载的细胞所需的时间，细胞培养在不同时间点采集。

胆固醇的流出从零到六小时呈线性变化，最大信号在ABD被添加到细胞中6小时后被捕获。通过测量含高密度脂蛋白不同百分比的胆固醇流出，测试饱和阈值和动态范围。在高通量资产中，流出量从 1% 线性演变为 7%ABDS，达到 7% 的胆固醇出血能力峰值，浓度高于 7%，荧光的强度与 ABDS 百分比成反比。

然后，通过比较荧光方法与标准无线电标记技术，对基于荧光的方法的性能进行了评价。当使用不同的 ABDS 浓度时，这两种技术都高度相关。所述方法对胆固醇出血值内接受物浓度的增加敏感，在 5 到 15% 之间，确保纤维素不含聚合物非常重要。

临界点是对含有环境的聚合乙醇进行分级，以均匀和最佳重量测量荧光。按照这个程序，可以测量名称技术胆固醇，并确定药物在胆固醇流走途径的影响。此外，学校最终被用作诊断评估心血管风险。

我们认为，这种方法比放射性标准方法更容易和安全得多。然而，它仍然是依赖于细胞。请记住，乙醇是易燃的，应相应地存储和处理。