Este protocolo es nuestro método basado en células para la terminación del colesterol del reflujo de colesterol en plasma ceramal. Particularmente en las proyecciones. Esto se puede aplicar para diagnosticar el riesgo cardiovascular, y para identificar o evaluar el mantenimiento más bajo del colesterol.
Esta técnica evita el riesgo y las cargas como la seguridad de la manipulación de materiales radiados proporcionando resultados con niveles de calidad comparables, a los del reflujo de colesterol se ha informado de asociarse con Así, el reflujo plasmático o de colesterol ceramal de aceptado se puede comparar, a nuestro control de referencia y puede proporcionar el riesgo de sufrir de este método también se aplicará a las líneas celulares , al igual que otras líneas celulares humanas o incluso macrofas primarias. Macro fases o y células madre de botón de pulverización inducidas por humanos. Para comenzar este procedimiento, disolver el colesterol NPD en etanol puro para obtener una solución de stock con una concentración final de dos micromolares.
Diluir 25 microlitros de la reserva de colesterol NBD en AR 10 medio para alcanzar una concentración final de cinco micromolares. Cultivo de células thp-1 en nuestro medio 10 a 37 grados celsius con 5% de dióxido de carbono. Cada tres días ajusta la densidad celular a 300000 células por mililitro.
A continuación, obtener una placa de 96 pozos con un fondo transparente plano. Para una mejor homogeneización, prepare 10 mililitros de células thp-1 en un tubo de 15 mililitros y agregue 200 microlitros de caldo de PMA. Mezclar suavemente y sembrar 100 microlitros de la mezcla en los pozos de la placa a 200.000 células por pozo.
E incubar a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono durante 48 a 72 horas para diferenciar las células thp-1 en células DM thp-1. Primera glicina diluida en 10%PBS con agua estéril, a una concentración de 200 micromolares a pH 7.4. Añadir 40 mililitros de glicina diluida a 10 gramos de peg 8000 para preparar una solución de 20%peg, y mezclar vigorosamente para homogeneizar.
A continuación, aplique cuatro partes del 20% por cada 10 partes de la muestra a cada muestra de suero o plasma en un tubo de 1,5 ml. Dejar la mezcla sobre hielo durante 25 minutos. Centrifugar la clavija apolipoproteína B precipitada a 13000 veces G, y a cuatro grados centígrados durante 15 minutos.
Deseche el precipitado y transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo. Recupere la placa que contiene las celdas thp-1 diferenciadas. Retire y deseche el medio de cultivo y, a continuación, lave las células dos veces con 1X PBS.
Añadir 100 microlitros de 5 micromolares de colesterol MVD en medio AR-10 a cada pozo. Incubar durante la noche a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono. Al día siguiente deseche, deseche el medio.
Lavar las células dos veces con PBS, y luego añadir 100 microlitros ABDS, o aceptador de lípidos purificado diluido en rpmi 1630 medio a la concentración deseada a cada pozo. Incluir un control negativo que no contenga aceptadores de colesterol en un control positivo, como se describe en el protocolo de texto, e incubar a 37 grados centígrados durante cuatro a seis horas. Mientras tanto, prepare un stock de 200 mililitros de solución de lysis celular uno como se describe en el texto.
Mezclar esta solución con etanol, en una relación volumétrica uno a uno para obtener la solución de lysis también. Para la detección de medios y colesterol BD, retire el medio celular de las placas recogidas en una nueva placa blanca de 96 pozos con un fondo plano opaco. Añadir 100 microlitros de etanol puro a 100 microlitros de cada muestra mediana para obtener una relación uno a uno en la nueva placa.
Usando un iluminador, mida la intensidad del fluorescente con una excitación de 463 nanómetros y una emisión de 536 nanómetros. Para la detección de colesterol NBD intracelular, lave las células dos veces con PBS. Añadir 100 microlitros de solución de lysis también a cada pozo, e incubar a temperatura ambiente, mientras se agita durante 25 minutos.
Después de esto, mida la intensidad del fluorescente mientras ajusta el parámetro de sensibilidad a 50 en el software. Luego determine la tasa de eflujo de colesterol en la medida final del eflujo del colesterol como se describe en el protocolo de texto. Diluir el colesterol NBD en etanol puro produce los valores de intensidad de los fluorescentes más altos, mientras que un alto contenido en solución acuosa, reduce la intensidad.
Esto sugiere que la emisión fluorescente de esta molécula depende en gran medida del medio, en el que está contenida. Cuando se utiliza una mezcla de medios y etanol en una relación uno a uno, la intensidad del fluorescente parece aumentar proporcionalmente, con una concentración del análogo del colesterol, lo que sugiere que la sonda se está comportando adecuadamente en estas condiciones. Para determinar la cantidad de tiempo necesario para incubar las células cargadas con aceptadores de colesterol, los medios celulares se cosechan en diferentes puntos de tiempo.
El eflujo de colesterol evolucionó linealmente de cero a seis horas, con la señal máxima capturada seis horas después de que se añade ABDS a las células. El umbral de saturación y el rango dinámico se prueban midiendo el eflujo del colesterol en diferentes porcentajes de medios que contienen HDL. En el activo de alto rendimiento, el eflujo evoluciona linealmente de uno a 7%ABDS, alcanzando el pico de capacidad de eflujo de colesterol en 7%A concentraciones superiores al 7% de la intensidad del fluroescente disminuye en una relación inversa con el porcentaje ABDS.
A continuación, se evalúa el rendimiento del método basado en fluorescencia comparándolo con la técnica radioetiquetado estándar. Ambas técnicas están altamente correlacionadas cuando se utilizan diferentes concentraciones de ABDS. El método descrito es sensible a un aumento de las concentraciones de aceptadores dentro de los valores de eflujo de colesterol entre cinco y 15%Es importante asegurarse de que el celulizador no contiene agregados.
El punto crítico es calificar un ambiente que contiene etanol agregado, para medir la fluorescencia en un peso homogéneo y óptimo. Después de este procedimiento, nombre colesterol técnico se puede medir, y el efecto de los medicamentos en la vía de eflujo de colesterol se puede determinar. También la escuela eventualmente ser utilizado como un diagnóstico para asses riesgo cardiovascular.
Creemos que este método es mucho más fácil y seguro que el método estándar radiactivo. Sin embargo, sigue siendo dependiente de la célula. Recuerde que el etanol es inflamable y debe almacenarse y manipularse en consecuencia.
