このプロトコルは、細胞血漿中のコレステロール逆流のコレステロール終了のための私達の細胞ベースの方法である。特にスクリーニングで。これは、心血管リスクを診断するために適用することができます, 識別またはコレステロール低いメンテナンスを評価します。.
この技術は、同等の品質レベルで結果を提供することにより放射物質を取り扱う際の安全性としてのリスクと負担を回避し、コレステロール還流の結果が従って関連すると報告されているが、受け入れられた血漿またはセラマルコレステロール還流を比較することができ、我々の参照制御に対してこの方法も細胞株に適用されるリスクを提供する可能性がある他のヒト細胞株や一次マクロ相と同様に。マクロ相またはヒト誘導スプレーボタン幹細胞。この手順を開始するには、NPDコレステロールを純粋なエタノールに溶解し、2つのマイクロモルの最終濃度でストック溶液を得る。
5マイクロモルの最終濃度に達するために、AR10培地でNBDコレステロールストックの25マイクロリットルを希釈する。37°Cで摂氏10培地中のthp-1細胞を5%の二酸化炭素で培養します。3日ごとに、1ミリリットル当たり300000個の細胞に細胞密度を調整します。
その後、平らな透明な底を持つ96ウェルプレートを得る。より良い均質化のために、15ミリリットルのチューブに10ミリリットルのthp-1細胞を調製し、PMAストックの200マイクロリットルを加えます。100,000個の細胞をウェルあたり200,000個のプレートウェルにそっと混ぜて100マイクロリットルのプレートウェルに混ぜます。
そして、thp-1細胞をDM thp-1細胞に分化するために、5%の二酸化炭素を5%の二酸化炭素で37°Cでインキュベートします。まず、滅菌水で10%PBSでグリシンを希釈し、pH7.4で200マイクロモルの濃度にする。40ミリリットルの希釈グリシンをペグ8000グラムに加えて20%ペグ溶液を調製し、均質化するために激しく混ぜます。
次に、1.5 mlチューブの各血清または血漿サンプルに、サンプルの10個あたり20%の4つの部分を適用します。混合物を氷の上に25分間放置します。ペグアポリポタンパク質Bを13000倍Gで沈殿させ、摂氏4度で15分間遠心分離する。
沈殿物を捨て、上清を新しいチューブに移します。分化した thp-1 細胞を含むプレートを取得します。培地を取り出して捨て、次いで1X PBSで細胞を2回洗浄する。
各ウェルにAR-10培地に5ミクロモルMVDコレステロールの100マイクロリットルを追加します。5%の二酸化炭素で摂氏37度で一晩インキュベートします。翌日は破棄し、培地を破棄します。
細胞をPBSで2回洗浄し、ABDSを100マイクロリットル加え、または精製した脂質アクセクターを各ウェルに所望の濃度にrpmi 1630培地で希釈した。テキストプロトコルに概説されているように、コレステロールアクセクサを含まない陰性コントロールを正の対照に含め、摂氏37度で4〜6時間インキュベートする。一方、テキストに概説されているように、細胞溶解溶液1の200ミリリットルのストックを調製する。
この溶液をエタノールと混合し、1対1の体積比で溶解溶液も得る。メディアおよびBDコレステロール検出の場合は、不透明な平らな底を持つ新しい白い96ウェルプレートに集められたプレートから細胞媒体を取り除きます。純エタノール100マイクロリットルを各培地サンプル100マイクロリットルに加え、新しいプレートで1対1の比率を得る。
照度計を使用して、463ナノメートルの励起で蛍光強度を測定し、536ナノメートルの放出を測定します。細胞内NBDコレステロール検出のために、PBSで細胞を2回洗浄します。100マイクロリットルの溶解溶液を各ウェルに加え、室温でインキュベートし、25分間振ります。
この後、ソフトウェアで感度パラメータを50に調整しながら蛍光度を測定します。次に、テキストプロトコルに概説されているように、コレステロール流出の最終尺度でコレステロール流出率を決定する。純粋なエタノール中でNBDコレステロールを希釈すると蛍光強度値が最も高くなり、水溶液中の含有量が高く、強度が低下します。
これは、この分子の蛍光発光が含まれる媒体に大きく依存していることを示唆している。1対1の比率で培地とエタノールを混合して使用する場合、蛍光強度は比例的に増加するようで、コレステロールアナログの濃度に伴い、プローブがこれらの条件下で適切に振る舞っていることを示唆している。コレステロールアクセクサでロードされた細胞をインキュベートするのに必要な時間を決定するために、細胞培地は異なる時点で収穫される。
コレステロール流出はゼロから6時間に直線的に進化し、ABDSが細胞に加えられた6時間後に最大シグナルが捕捉された。飽和閾値およびダイナミックレンジは、HDL含有媒体の異なる割合でコレステロール流出を測定することによって試験される。高スループット資産では、流出は1から7%ABDSに直線的に進化し、7%でコレステロール流出容量のピークに達し、7%より高い濃度で、ABDSパーセントとの逆関係で蛍光症の強度が低下する。
蛍光ベースの方法の性能は、標準のラジオ標識技術と比較することによって評価される。ABDSの異なる濃度を使用する場合、両方の技術は非常に相関しています。上記の方法は、コレステロール流出値内のアクセプター濃度の増加に対して感受性が5〜15%の間で、セルアリゼが凝集体を含みないようにすることが重要である。
重要な点は、エタノール含有環境を凝集体し、均質で蛍光を測定し、最適な重量を採点する。この手順に従って、名前の技術的なコレステロールを測定することができ、コレステロール流出経路における薬物の効果を決定することができる。また、学校は最終的に心血管リスクを装う診断として使用されます。
放射性標準法に比べ、よりずっと簡単で安全だと考えています。しかし、それはまだセルに依存しています。エタノールは可燃性であり、それに応じて保管・取り扱うべきであることを覚えておいてください。
