이 프로토콜은 뇌혈장에서 콜레스테롤 역류의 콜레스테롤 종결을 위한 우리의 세포 기지를 둔 방법입니다. 특히 상영에서. 이것은 심장 혈관 리스크를 진단하기 위하여 적용될 수 있고, 콜레스테롤을 확인하거나 평가하기 위하여 더 낮은 유지 보수.
이 기술은 유사한 품질 수준을 가진 결과를 제공함으로써 방사된 물질을 취급하는 안전성으로서의 위험과 부담을 피하고, 콜레스테롤 역류의 것과 연관된 것으로 보고되어, 허용되는 혈장 또는 뇌콜레스테롤 역류를 비교할 수 있고, 우리의 기준 대조군과 비교하여, 이러한 방법으로 고통받는 위험을 제공할 수 있다. , 다른 인간 세포주 또는 심지어 1 차적인 매크로 단계와 같이. 매크로 상 또는 인간 유도 스프레이 버튼 줄기 세포. 이 절차를 시작하려면, 2개의 마이크로몰러의 최종 농도를 가진 주식 용액을 얻기 위하여 순수 에탄올에 NPD 콜레스테롤을 녹입니다.
AR 10 배지에서 NBD 콜레스테롤 재고의 25 마이크로리터를 희석하여 5개의 마이크로몰라의 최종 농도에 도달합니다. 배양 thp-1 세포는 이산화탄소 5%를 가진 섭씨 37도에서 우리의 10 배지에 있습니다. 3일마다 밀리리터당 세포 밀도를 300000세포로 조절합니다.
그런 다음 평평한 투명 바닥으로 96 웰 플레이트를 얻습니다. 더 나은 균질화를 위해 15 밀리리터 튜브에 10 밀리리터의 thp-1 세포를 준비하고 200 마이크로리터의 PMA 스톡을 추가하십시오. 부드럽게 혼합하고 잘 당 200, 000 세포에서 접시 우물에 혼합물의 100 마이크로 리터를 시드.
그리고 48~72시간 동안 5%의 이산화탄소로 섭씨 37도에서 배양하여 thp-1 세포를 DM thp-1 세포로 분화시한다. 먼저 멸균물로 10%PBS로 글리신을 희석하고, pH 7.4에서 200 마이크로몰라농도로 희석한다. 희석된 글리신 40밀리리터를 10그램의 페그 8000에 넣고 20%페그 용액을 준비하고, 균질화하기 위해 힘차게 섞습니다.
다음으로 1.5ml 튜브에 각 혈청 또는 플라즈마 샘플에 샘플 10개 부분당 20%의 4부분을 적용합니다. 혼합물을 얼음 위에 25분 간 둡니다. 원심분리기 페그 아폴리포프로틴 B는 13,000배, 섭씨 4도에서 15분 동안 침전시켰다.
침전을 버리고 상체를 새 튜브로 옮기십시오. 분화 된 thp-1 셀을 포함하는 플레이트를 검색합니다. 배양 배지를 제거하고 폐기한 다음 1X PBS로 셀을 두 번 세척합니다.
AR-10 배지에 5마이크로몰러 MVD 콜레스테롤100마이크로리터를 각 웰에 추가합니다. 이산화탄소 5%와 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 배양하십시오. 다음 날 폐기하고 매체를 폐기하십시오.
PBS로 세포를 두 번 세척한 다음 100개의 마이크로리터 ABDS를 추가하거나, rpmi 1630 배지에서 희석된 정제지질 수용기를 각각 양호한 농도로 첨가한다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 콜레스테롤 수용자가 긍정적 인 대조군으로 포함되지 않는 부정적인 제어를 포함하고 4 ~ 6 시간 동안 섭씨 37도에서 배양하십시오. 한편, 텍스트에 설명된 대로 셀 용해 용액의 200 밀리리터 스톡을 준비한다.
이 솔루션을 일대일 체피 비율로 에탄올과 혼합하여 용액을 얻습니다. 미디어 및 BD 콜레스테롤 검출의 경우 불투명한 평평한 바닥으로 새로운 흰색 96웰 플레이트에서 수집된 플레이트에서 세포 배지를 제거합니다. 100 마이크로리터의 순수 에탄올을 각 중간 시료의 100 마이크로리터에 추가하여 새로운 플레이트에서 일대일 비율을 얻습니다.
조명계를 사용하여 463 나노미터의 발산과 536 나노미터의 방출에서 형광의 강도를 측정합니다. 세포 내 NBD 콜레스테롤 검출을 위해 PBS로 세포를 두 번 씻으시면 됩니다. 각 웰에 용해 용액 100 마이크로리터를 추가하고 실온에서 25분 동안 흔들리면 배양합니다.
그런 다음 소프트웨어에서 감도 매개 변수를 50으로 조정하면서 형광의 강도를 측정합니다. 그런 다음 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 콜레스테롤 efflux의 최종 측정에서 콜레스테롤 efflux 비율을 결정합니다. 순수 에탄올에서 NBD 콜레스테롤을 희석하면 가장 높은 형광강도 값을 생성하고 수성 용액의 함량이 높으며 강도를 낮춥춥습니다.
이것은 이 분자의 형광의 방출이 포함하는 매체에 높게 의존한다는 것을 건의합니다. 일대일 비율로 미디어와 에탄올의 혼합물을 사용하는 경우, 형광의 강도는 콜레스테롤 아날로그의 농도와 함께 비례적으로 증가하는 것으로 보이며, 이러한 조건하에서 프로브가 적절하다고 제안합니다. 콜레스테롤 수용기로 로드된 세포를 배양하는 데 필요한 시간을 결정하기 위해 세포 매체는 다른 시점에서 수확됩니다.
콜레스테롤 efflux는 ABDS가 세포에 추가된 후에 6 시간 포착되는 최대 신호와 함께 0에서 6 시간까지 선형적으로 진화했습니다. 포화 임계값 및 동적 범위는 미디어를 포함하는 HDL의 다른 비율로 콜레스테롤 efflux를 측정하여 테스트됩니다. 높은 처리량 자산에서, efflux는 1에서 7%ABDS로 선형적으로 진화하여 콜레스테롤 efflux 용량의 피크에 도달하여 7% 이상의 농도에서 ABDS 백분율과의 역관계에서 플루로센트의 강도가 감소합니다.
형광 계 방법의 성능은 표준 무선 표지 기술과 비교하여 평가된다. 두 기술은 ABDS의 다른 농도를 사용할 때 매우 상관 관계가 있습니다. 상기 기술된 방법은 5~15%의 콜레스테롤 효율값 내의 수용체 농도의 증가에 민감하여 셀루아라이저에 골재가 포함되어 있지 않도록 하는 것이 중요하다.
임계점은 환경을 포함하는 집계 에탄올을 채점하고, 균질하고, 최적의 중량으로 형광을 측정하는 것입니다. 이 절차에 따라, 이름 기술 콜레스테롤을 측정할 수 있고, 콜레스테롤 efflux 통로에 있는 약의 효력을 결정할 수 있습니다. 또한 학교는 결국 심장 혈관 위험을 소인하는 진단으로 사용됩니다.
우리는이 방법이 방사성 표준 방법보다 훨씬 쉽고 안전하다고 믿습니다. 그러나 여전히 셀에 의존적입니다. 에탄올은 인화성이며 그에 따라 저장및 처리해야 한다는 것을 기억하십시오.
