肠体是从肠道上皮细胞中提取的三维器官。它们是研究复杂生理相互作用、细胞信号和宿主病原体防御的的理想之选。我们的协议描述了在接受肠切除的患者中隔离肠道干细胞后如何培养人肠。
在我们的培养媒体中，合用利多糖会导致肠内炎症反应，导致组织学、遗传和蛋白质表达改变，类似于人类坏死性肠结肠炎中见的。鉴于对坏死性肠结肠炎和潜在治疗剂的研究在人类主体中，特别是儿童中具有伦理挑战性，利用这种利用人类新生儿组织坏死性肠结肠炎的新颖、生物相关肠体模型是非常可取的。该技术的主要优点是，肠道能够重述人类肠道上皮的多种细胞类型，并能够克服动物模型和基于细胞的系统所承认的局限性。
帮助演示手术的将是外科住院病人克里斯蒂·邦帕内和实验室技术员袁嘉莉。在手术套件中采集时，将人体小肠道组织样本放在冷的DPBS中。在冰冷的 DPBS 中清洗标本，直到没有血迹和粪便。
将试样存放在 RPMI 1640 介质中，温度为 4 摄氏度，直到准备好进行加密隔离。准备继续操作时，再次检查标本是否远离粪便和血迹。使用精致的解剖剪刀去除多余的脂肪或手术夹和订书针。
对样品进行重量，并瞄准大约 0.75 至 2.5 克的片断。接下来，将组织切成0.5厘米的碎片，并把它们放在一个管子里，里面装着30毫升的溷合缓冲液。在4摄氏度下以低速摇晃15分钟。
然后，通过100微米细胞滤株过滤组织，并丢弃流经。将过滤的组织添加到含有30毫升溷合缓冲液二号管中。在4摄氏度下以低速摇晃15分钟。
通过 100 微米过滤器过滤组织，然后丢弃流经。在此之后，在冰上解冻500微升的地下室膜基质供以后使用。在50毫升锥形管中加入10毫升冷DMEM组织，用手大力摇动10秒。
通过 100 微米细胞滤株过滤此悬浮液，然后收集流经。把管子放在冰上在单独的 50 毫升锥形管中再加入 10 毫升冷 DMEM 中的一些组织，用手大力摇动 10 秒钟。
通过 100 微米细胞滤株过滤此悬浮液，然后收集流经。重复此过程两次，直到有四个锥形管包含流通过标记一个到四个。然后，通过100微米电池滤株过滤1号管中的溶液，将流量转移到15毫升锥形管中，也标有1号。
对管二到四重复此过程。将15毫升管在200倍G和4摄氏度下离心15分钟。在层流罩中，从每个管中拆下上流液并丢弃。
避免破坏颗粒上方的组织云，即使这意味着留下一些上一液。在每个管中，移液器上下缓慢地将颗粒与剩余的上流液混合。将混合物从每个管转移到一个两毫升锥形管中，在200倍G和4摄氏度下离心20分钟。
在此之后，去除上经剂，并在预解冻的地下膜基质的500微升中重新暂停颗粒。使用冰镇移液器尖端将 50 微升的悬架应用到 24 井板的井中心。此示例应显示为圆顶形状。
重复此应用过程九次，以填充 10 个总井。将 24 个井板转移到 37 摄氏度的 5% 二氧化碳培养箱中 30 分钟，以便进行聚合。然后，在每一个井中加入500微升的人类微糖介质。
在相同条件下继续孵育，确保每两天更换一次该介质。首先，在第 0 天将 5 微升的 LPS 添加到 5 微升的人类微升介质中，每毫升浓度为 5 毫克。继续在37摄氏度下用5%的二氧化碳孵育，并每两天更换一次补充的介质，直到收集。
要准备石蜡嵌入，首先轻轻去除介质，加入一毫升PBS，并轻轻地上下移液器溶解地下室膜基质，同时小心不要将肠子拉丝。以低于 300 倍 G 的速度离心，5 分钟进行颗粒化，然后取出 PBS。加入4%的甲醛，将管子放在一边一小时，在室温下固定。
以低于 300 倍 G 的速度离心，5 分钟进行颗粒化，然后去除半成醛。用一毫升 PBS 轻轻清洗，以低于 300 倍 G 的速度离心，五分钟。然后删除 PBS。
使用 PBS 重复此洗涤过程一次。将所需数量的组织加工凝胶放入锥形管中，在65摄氏度的干浴培养箱中加热3至10分钟，直到其变成液体。在此之后，将熔化的组织加工凝胶加入颗粒中，轻轻混合。
将一个小克隆环放入盖玻片中。将组织加工凝胶和肠状混合物移入安装在盖玻片上的克隆环中。让组织加工凝胶和肠状混合物在四摄氏度下凝固一小时。
然后，将克隆环与凝固混合物一起淹没到70%乙醇中，为石蜡嵌入做准备。电镀后，刚隔离的肠道墓穴立即显示为拉长棒。在几个小时内，输入体将采取圆形的外观。
在接下来的几天里，这些球体将开始形成球体。萌芽应发生在 5 到 10 天之间，即当输入收集应发生。生长的输入体也表现出极性，包含集中的流明、一个点状边框和一个罗勒边域。
肠子也显示结构完整性，以健壮的细胞骨架表示。经过几天的培养，LBS治疗的肠菌体经历更多的凋亡，具有低于对照组的产量。如NEC的人类NEC模型中显示的，与对控相比，在LPS治疗的肠状体中，像受体4一样收费的表达增加。
还可以利用成熟的 qRT-PCR 和西方印迹技术进行基因表达和蛋白质分离，为RNA和蛋白质提取收集肠素。
