Энтероиды являются трехмерными органоидами, полученными из кишечных эпителиальных клеток. Они идеально подходят для изучения сложных физиологических взаимодействий, клеточной сигнализации и защиты патогенов-хозяина. Наш протокол описывает, как культуры человека энтероидов после изоляции кишечных стволовых клеток от пациентов, проходящих дефекции.
Совместное администрирование липополисахарид в наших культурных средствах массовой информации вызывает воспалительные реакции у энтероидов, что приводит к гистологическим, генетическим и белковым изменениям экспрессии, аналогичным тем, которые наблюдается в некротизирующем энтероколите человека. Учитывая, что изучение некротизирующего энтероколита и потенциальных терапевтических агентов является этически сложной задачей у людей, особенно детей, очень желательно использовать эту новую, биологически релевантную энтероидную модель некротизирующего энтероколита с использованием неонатальной ткани человека. Основным преимуществом этой техники является то, что энтероиды способны резюмировать несколько типов клеток кишечного эпителия человека и способны преодолеть признанные ограничения животных моделей и клеточных систем.
Помочь продемонстрировать процедуру будут Кристи Buonpane, хирургический резидент, и Кэрри Yuan, лаборант из нашей лаборатории. Во время сбора в оперативном наборе поместите человеческий маленький образец кишечной ткани в холодный DPBS. Вымойте образец в холодном DPBS, пока он не будет очищен от крови и стула.
Храните образец в RPMI 1640 среды при четырех градусах по Цельсию до готовности к изоляции склепа. Когда готовы приступить, проверьте еще раз, что образец очищается от стула и крови. Использование деликатных рассечения ножниц удалить излишки жира или хирургические клипы и скобы.
Вес образца и стремиться к кусок, который составляет примерно 0,75 до 2,5 граммов. Затем разрежьте ткань на 0,5 сантиметра и поместите их в трубку, содержащую 30 миллилитров хелатирующего буфера номер один. Встряхните на низкой скорости в течение 15 минут при четырех градусах по Цельсию.
Затем процедите ткань через 100-метровый клеточный ситечко и отбросьте поток. Добавьте фильтрованную ткань в трубку, содержащую 30 миллилитров хелатирующего буфера номер два. Встряхните на низкой скорости в течение 15 минут при четырех градусах по Цельсию.
Фильтр ткани через 100 микрометровый фильтр и отбросить поток до конца. После этого оттепель 500 микролитров мембранной матрицы подвала на льду для более длительного использования. Добавьте немного ткани до 10 миллилитров холодного DMEM в 50 миллилитровой конической трубки и энергично встряхните вручную в течение 10 секунд.
Фильтр этой подвески через 100 микрометровый ситечко клетки и собирать поток до конца. Держи эту трубку на льду. Добавьте немного ткани еще к 10 миллилитров холодного DMEM в отдельной 50 миллилитровой конической трубке и встряхните энергично вручную в течение 10 секунд.
Фильтр этой подвески через 100 микрометровый ситечко клетки и собирать поток до конца. Повторите этот процесс еще два раза, пока есть четыре конические трубки, содержащие поток через помечены один через четыре. Затем отфильтруй раствор в трубке номер один через 100-метровый клеточный ситечко и перенесите поток в 15-миллилитровую коническую трубку, также помеченную номером один.
Повторите этот процесс для трубок от двух до четырех. Центрифуга 15 миллилитров труб при 200 раз G и при четырех градусах по Цельсию в течение 15 минут. В ламинарный капюшон потока, удалить supernatant из каждой трубки и отказаться от него.
Избегайте нарушения облако ткани непосредственно над гранулами, даже если это означает, что оставить некоторые supernatant позади. В каждой трубке, пипетка вверх и вниз медленно, чтобы смешать гранулы с остатками супернатанта. Перенесите смесь из каждой трубки в одну двухми миллилитровую коническую трубку и центрифугу при 200 градусах G и при четырех градусах Цельсия в течение 20 минут.
После этого удалите супернатант и повторно посовелите гранулы в 500 микролитров предварительно размороженой мембранной матрицы подвала. Используйте охлажденный наконечник пипетки, чтобы применить 50 микролитров этой подвески к центру хорошо в 24 пластины хорошо. Этот образец должен появиться в форме купола.
Повторите этот процесс подачи заявки девять раз, чтобы заполнить 10 общих скважин. Перенесите 24 хорошо пластины в 5%carbon двуокиси инкубатор при 37 градусов по Цельсию в течение 30 минут, чтобы полимеризации. Затем добавьте 500 микролитров человеческих минигутных средств массовой информации в комплекте с каждой хорошо.
Продолжайте инкубацию в тех же условиях, убедившись, что заменить этот медиа каждые два дня. Во-первых, добавьте 10 микролитров LPS при концентрации в пять миллиграммов на миллилитр до 500 микролитров человеческого минигута, завершенных в каждом колодеце пластины на нулевом дне. Продолжайте инкубацию при 37 градусах По Цельсию с 5%-ным углекислым газом и замените дополненные средства каждые два дня до сбора.
Чтобы подготовиться к встраиванию парафина, сначала аккуратно удалите средства массовой информации, добавьте один миллилитр PBS и аккуратно пипетку вверх и вниз, чтобы растворить матрицу мембраны подвала, будучи осторожными, чтобы не подставить энтероиды. Центрифуга на скорости менее 300 раз G в течение пяти минут, чтобы гранулы, а затем удалить PBS. Добавить 4%paraformaldehyde и установить трубку в сторону в течение одного часа, чтобы исправить при комнатной температуре.
Центрифуга со скоростью менее 300 раз G в течение пяти минут, чтобы гранулировать, а затем удалить параформальдегид. Вымойте осторожно с одним миллилитров PBS и центрифуги на скорости менее 300 раз G в течение пяти минут. Затем удалите PBS.
Повторите этот процесс мытья с PBS один раз. Поместите нужное количество геля обработки тканей в коническую трубку и разогреете его в инкубаторе сухой ванны при 65 градусах по Цельсию в течение трех-десяти минут, пока он не будет жидким. После этого добавьте гель для обработки расплавленной ткани в гранулы и аккуратно перемешайте.
Поместите небольшое клонирование кольца в крышку. Pipette ткани обработки геля и энтероидной смеси в клонирование кольцо, которое устанавливается на крышку. Разрешить ткани обработки геля и энтероидной смеси затвердеть при четырех градусах по Цельсию в течение одного часа.
Затем погрузите клонирование кольца с затверденой смесью в 70% этанола для подготовки к встраиванию парафина. Сразу же после покрытия, свежеизоляционные кишечные склепы появляются как удлиненные стержни. В течение нескольких часов энтероиды будут принимать круглый вид.
В течение следующих нескольких дней энтероиды начнут формировать сферы. Подающий надежды должен происходить от пяти до 10 дней, то есть, когда энтероидный сбор должен произойти. Растущие энтероиды также обладают полярностью, содержащей централизованный люмен, апикал-границу и базилатеральный домен.
Энтероиды также показывают структурную целостность, представленную надежным актином цитоскелета. После нескольких дней в культуре, LBS лечение энтероидов опыт более апоптоза и имеют более низкую урожайность, чем контрольная группа. Как видно из человека NEC в муриновых моделях NEC, увеличение экспрессии пошлины, как рецептор четыре находится в LPS лечение энтероидов по сравнению с контроля.
Энтероиды также могут быть собраны для извлечения РНК и белка с использованием хорошо установленных qRT-PCR и западных методов blotting экспрессии генов и белковой изоляции могут быть выполнены.
