Os enteróides são organoides tridimensionais derivados de células epiteliais intestinais. São ideais para o estudo de interações fisiológicas complexas, sinalização celular e defesa de patógenos hospedeiros. Nosso protocolo descreve como cultivar enteróides humanos depois de isolar células-tronco intestinais de pacientes submetidos à ressecção intestinal.
A coadministração de lipopolisacarídeo em nossa mídia cultural causa uma resposta inflamatória nos enteróides levando a alterações histológicas, genéticas e de expressão proteica semelhantes às vistas na enterocolite necrosante humana. Dado que o estudo da enterocote necrosante e potenciais agentes terapêuticos é eticamente desafiador em seres humanos, especialmente crianças, é altamente desejável utilizar esse novo modelo enteróide biologicamente relevante de enterocolite necrosante utilizando tecido neonatal humano. A principal vantagem dessa técnica é que os enteróides são capazes de recapitular os múltiplos tipos de células do epitélio intestinal humano e são capazes de superar as limitações reconhecidas de modelos animais e sistemas baseados em células.
Ajudando a demonstrar o procedimento estarão Christie Buonpane, uma residente cirúrgica, e Carrie Yuan, uma técnica de laboratório do nosso laboratório. No momento da coleta na suíte operativa, coloque a amostra de tecido intestinal humano em DPBS frio. Lave o espécime no DPBS frio até que esteja livre de sangue e fezes.
Armazene a amostra em meio RPMI 1640 a quatro graus Celsius até estar pronto para o isolamento da cripta. Quando estiver pronto para prosseguir, verifique novamente se o espécime está livre de fezes e sangue. O uso de uma tesoura de dissecação delicada remove qualquer excesso de gordura ou clipes cirúrgicos e grampos.
Pesar a amostra e apontar para uma peça que é de aproximadamente 0,75 a 2,5 gramas. Em seguida, corte o tecido em pedaços de 0,5 centímetros e coloque-os em um tubo contendo 30 mililitros de tampão de quesequente número um. Agite em baixa velocidade por 15 minutos a quatro graus Celsius.
Em seguida, filtre o tecido através de um coador de células de 100 micrômetros e descarte o fluxo através. Adicione o tecido filtrado a um tubo contendo 30 mililitros de tampão de quesequente número dois. Agite em baixa velocidade por 15 minutos a quatro graus Celsius.
Filtre o tecido através de um filtro de 100 micrômetros e descarte o fluxo através. Depois disso, descongele 500 microliters da matriz de membrana do porão no gelo para uso posterior. Adicione um pouco de tecido a 10 mililitros de DMEM frio em um tubo cônico de 50 mililitros e agite vigorosamente à mão por 10 segundos.
Filtre esta suspensão através de um filtro de célula de 100 micrômetros e colete o fluxo através. Mantenha este tubo no gelo. Adicione um pouco de tecido a outros 10 mililitros de DMEM frio em um tubo cônico separado de 50 mililitros e agite vigorosamente à mão por 10 segundos.
Filtre esta suspensão através de um filtro de célula de 100 micrômetros e colete o fluxo através. Repita o processo duas vezes adicionais até que haja quatro tubos cônicos contendo fluxo através de um a quatro rotulados. Em seguida, filtrar a solução no tubo número um através de um coador de células de 100 micrômetros e transfira o fluxo através de um tubo cônico de 15 mililitros também rotulado como número um.
Repita este processo para tubos de dois a quatro. Centrifugar os tubos de 15 mililitros a 200 vezes G e a 4 graus Celsius por 15 minutos. Na capa de fluxo laminar, remova o sobrenante de cada tubo e descarte-o.
Evite interromper a nuvem de tecido imediatamente acima da pelota, mesmo que isso signifique deixar algum sobrenatante para trás. Em cada tubo, pipeta para cima e para baixo lentamente para misturar a pelota com o supernatante restante. Transfira a mistura de cada tubo em um único tubo cônico de dois mililitros e centrífuga a 200 vezes G e a quatro graus Celsius por 20 minutos.
Depois disso, remova o supernascer e resuspenja a pelota em 500 microliters de matriz de membrana de porão pré-descongelada. Use uma ponta de pipeta gelada para aplicar 50 microliters desta suspensão ao centro de um poço em uma placa de 24 poços. Esta amostra deve aparecer em forma de cúpula.
Repita este processo de inscrição nove vezes para preencher 10 poços totais. Transfira a placa de 24 poços para uma incubadora de dióxido de carbono de 5% a 37 graus Celsius por 30 minutos para permitir a polimerização. Em seguida, adicione 500 microliters de mídia de minigut humano completa a cada poço.
Continue incubando sob as mesmas condições, certificando-se de substituir esta mídia a cada dois dias. Primeiro, adicione 10 microliters de LPS a uma concentração de cinco miligramas por mililitro aos 500 microliters de mídia de minigut humanos completados em cada poço da placa no dia zero. Continue incubando a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono e substitua a mídia suplementada a cada dois dias até a coleta.
Para se preparar para a incorporação da parafina, primeiro remova suavemente a mídia, adicione um mililitro de PBS e cochique suavemente para cima e para baixo para dissolver a matriz de membrana do porão enquanto tome cuidado para não lise os enteroides. Centrifugar a uma velocidade inferior a 300 vezes G durante cinco minutos para pelotas e, em seguida, remover o PBS. Adicione 4% de paraformaldeído e reserve o tubo por uma hora para fixar à temperatura ambiente.
Centrifugar a uma velocidade inferior a 300 vezes G durante cinco minutos para pelotas e, em seguida, remover o paraformaldeído. Lave suavemente com um mililitro de PBS e centrífuga a uma velocidade inferior a 300 vezes G durante cinco minutos. Em seguida, remova o PBS.
Repita este processo de lavagem com PBS uma vez. Coloque a quantidade desejada do gel de processamento de tecido em um tubo cônico e aqueça-o em uma incubadora de banho seco a 65 graus Celsius por três a 10 minutos até que seja líquido. Depois disso, adicione o gel de processamento de tecido derretido à pelota e misture delicadamente.
Coloque um pequeno anel de clonagem em uma mancha de cobertura. Pipeta o gel de processamento de tecido e a mistura enteróide no anel de clonagem que é montado em uma mancha de cobertura. Deixe que o gel de processamento de tecido e a mistura enteróide se solidifiquem a quatro graus Celsius durante uma hora.
Em seguida, submergir o anel de clonagem com a mistura solidificada em 70% de etanol para se preparar para a incorporação da parafina. Imediatamente após o revestimento, as criptas intestinais recém-isoladas aparecem como hastes alongadas. Dentro de horas, os enteróides terão uma aparição redonda.
Nos próximos dias, os enteróides começarão a formar esferas. O brotamento deve ocorrer entre cinco a dez dias, que é quando a coleta enteróide deve ocorrer. Os enteróides em crescimento também exibem polaridade, contendo um lúmen centralizado, uma fronteira apical e um domínio basilateral.
Os enteróides também mostram integridade estrutural representada por um forte citoesqueleto de actin. Após vários dias na cultura, os enteróides tratados da LBS experimentam mais apoptose e têm um rendimento menor do que o grupo controle. Como visto na NEC humana em modelos murinos de NEC, uma expressão aumentada de pedágio como o receptor quatro é encontrada em enteróides tratados LPS em comparação com os controles.
Os enteróides também podem ser coletados para extração de RNA e proteínas usando técnicas bem estabelecidas de qRT-PCR e de blotting ocidental e técnicas de blotting ocidental expressão genética e isolamento de proteínas podem ser realizadas.
