腸管は、腸上皮細胞に由来する3次元オルガノイドである。これらは、複雑な生理学的相互作用、細胞シグナル伝達、および宿主病原体防御の研究に理想的である。私たちのプロトコルは、腸切除を受けている患者から腸幹細胞を分離した後、ヒトエンタノイドを培養する方法を説明しています。
私たちの培養培地におけるリポ多糖の共投与は、ヒト壊死性腸炎に見られるものと同様の組織学的、遺伝的、およびタンパク質発現変化をもたらす腸内の炎症反応を引き起こす。壊死性腸炎および潜在的な治療剤の研究は、ヒトの被験者、特に小児において倫理的に困難であることを考えると、この新しい、生物学的に関連するヒト新生児組織を用いた壊死性腸炎の腸内膜モデルを利用することが非常に望ましい。この技術の主な利点は、エンテロイドがヒト腸上皮の複数の細胞タイプを再現することができ、動物モデルおよび細胞ベースのシステムの認識された限界を克服することができるということです。
手順のデモンストレーションを手伝うクリスティ・ブオンパネ、外科居住者、キャリー・ユアン、私たちの研究室の研究室の技術者です。手術室での採取時に、ヒトの小腸組織サンプルを冷たいDPBSに入れる。血液や便が透明になるまで、冷たいDPBSで検体を洗います。
検体は、解読の準備ができるまで、摂氏4度でRPMI 1640培地に保管してください。続行する準備ができたら、標本が便と血液が透明であることをもう一度確認してください。繊細な解剖ハサミを使用して、余分な脂肪や外科用クリップやステープルを取り除きます。
標本に重みを付け、約0.75〜2.5グラムの部分を目指します。次に、組織を0.5センチメートルに切り、30ミリリットルのキレートバッファー番号1を含むチューブに入れます。摂氏4度で15分低速で振ります。
その後、100マイクロメートルの細胞ストレーナーを通して組織を濾過し、流れを通して廃棄する。30ミリリットルのキレートバッファー番号2を含むチューブに濾過した組織を加えます。摂氏4度で15分低速で振ります。
100マイクロメートルのフィルターを通してティッシュをフィルターし、流れを通して捨てる。この後、氷上で500マイクロリットルの基質膜マトリックスを解凍し、後で使用します。50ミリリットル円錐形チューブに冷たいDMEMの10ミリリットルにいくつかの組織を追加し、10秒間手で精力的に振ります。
100マイクロメートルの細胞のストレーナを通してこの懸濁液をフィルターし、流れを通して集める。このチューブを氷の上に置いておきなさい。別の50ミリリットルの円錐管に別の10ミリリットルの冷たいDMEMにいくつかの組織を追加し、10秒間手で精力的に振ります。
100マイクロメートルの細胞のストレーナを通してこの懸濁液をフィルターし、流れを通して集める。ラベルが付いた1から4までの流れを含む4つの円錐形の管があるまで、このプロセスをさらに2回繰り返します。次いで、チューブ1の溶液を100マイクロメートルの細胞ストレーナーを通して濾過し、流れを15ミリリットルの円錐管に移す。
チューブ2~4本に対してこのプロセスを繰り返します。15ミリリットルのチューブをGの200倍、摂氏4度で15分間遠心分離します。層流フード内で、各チューブから上清を取り除き、廃棄します。
それは後ろにいくつかの上澄を残すことを意味する場合でも、ペレットの上に組織の雲を破壊しないように。各チューブにピペットを上下にゆっくりとしてペレットを残りの上清と混合する。各チューブから混合物を200倍Gで1つの2ミリリットル円錐形チューブと遠心分離機に移し、摂氏4度で20分間移動します。
この後、上清を取り除き、解凍前の基底膜マトリックスの500マイクロリットルでペレットを再懸濁します。冷やしたピペットチップを使用して、この懸濁液の50マイクロリットルを24ウェルプレートのウェルの中央に塗布します。このサンプルはドーム型に見えるはずです。
この申請プロセスを9回繰り返して、合計10の井戸を埋めます。24ウェルプレートを摂氏37度で5%の二酸化炭素インキュベーターに30分間移し、重合を可能にします。その後、各井戸に完了した人間のミニグットメディアの500マイクロリットルを追加します。
同じ条件でインキュベートを続け、2日ごとにこの培地を交換してください。まず、ゼロ日にプレートの各ウェルに完了する人間のミニグットメディアの500マイクロリットルに1ミリリットル当たり5ミリグラムの濃度でLPSの10マイクロリットルを追加します。摂氏37度で5%の二酸化炭素でインキュベートを続け、回収まで2日ごとに補充された培地を交換してください。
パラフィン埋め込みの準備をするには、まず培地をそっと取り出し、PBSを1ミリリットル加え、ピペットを上下に軽くピペットして基部膜マトリックスを溶解させ、エンタフィドを溶かしないように注意します。遠心分離機をGの300倍未満で5分間ペレットしてから、PBSを取り除いた。4%パラホルムアルデヒドを加え、室温で固定するために1時間チューブを脇に置きます。
遠心分離機はGの300倍未満の速度で5分間ペレットし、パラホルムアルデヒドを取り除いた。PBSと遠心分離機を1ミリリットルで1ミリリットルG未満の速度で5分間やさしく洗います。その後、PBSを削除します。
PBSでこの洗浄プロセスを1回繰り返します。所望の量の組織処理ゲルを円錐形のチューブに入れ、液体になるまで摂氏65度の乾燥浴インキュベーターで3〜10分間温めます。その後、溶かした組織加工ゲルをペレットに加え、軽く混ぜます。
小さなクローニングリングをカバースリップに入れる。組織処理ゲルをピペットし、カバースリップに取り付けられたクローニングリングにエンタロイド混合物を入れます。組織加工ゲルと腸骨混合物を摂氏4度で1時間固めます。
次いで、凝固混合物を含むクローニングリングを70%エタノールに沈め、パラフィン埋め込みの準備を行う。めっき直後に、孤立したばかりの腸内窩は細長い棒として現れる。数時間のうちに、エンタイドは丸い外観になります。
次の数日間、エンテロイドは球体の形成を開始します。芽出しは、enteroidコレクションが発生する場合、5〜10日の間に発生する必要があります。成長するエンタイドはまた、中央の内腔、尖路境界、および底面ドメインを含む極性を示す。
エンタロイドはまた、堅牢なアクチン細胞骨格によって表される構造的完全性を示す。培養で数日後、LBS治療腸内は、より多くのアポトーシスを経験し、対照群よりも低い収率を有する。NECのマウスモデルにおけるヒトNECに見られるように、コントロールと比較してLPS処理エンタノイドに受容体4のような通行料の発現が増加していることが判明した。
また、遺伝子発現およびタンパク質の分離を行うことができる、よく確立されたqRT-PCRおよびウェスタンブロッティング技術を用いてRNAおよびタンパク質抽出のためにエンタノイドを収集することもできる。
