光漂白后现有的荧光恢复，FRAP协议，要么不完整，要么过于复杂。此视频中介绍的协议非常重要，因为它全面、实用且简单明了。这种 FRAP 技术的主要优点是，它允许在活细胞中亚细胞隔间内和之间的蛋白质流动性进行定量。
FRAP正在研究治疗和诊断目的。其中一种用途是量化体内不同组织内药物输送系统内的扩散。此信息可以通过用于优化药物结构和成分。
FRAP显微镜技术在理解扩散现象的广阔领域提供了见解。其中包括细胞和分子生物学、发育生物学、神经科学、材料科学、高级生物材料和药物发现。虽然所述协议适用于哺乳动物细胞，但概念可应用于其他系统，如植物细胞、酵母细胞和细菌。
从未执行过此技术的个人可能难以确定最佳图像采集参数、创建适合其实验的采集区域以及计算移动分数和恢复的一半。首次尝试此过程时，请务必执行多个试验性实验，以在实验目标上下文中优化协议。演示该程序将由我实验室的技术人员马琳·卡贝和核心成像设施经理大卫·拉德马赫负责。
首先，准备一盘YFP-p62转染RAF264.7巨噬细胞，并如所附文本协议所述，用脂质糖进行治疗。接下来，用冰冷的泰洛德缓冲液冲洗处理过的细胞。然后，在板片中加入两毫升诺科达佐尔补充的Tyrode缓冲液，让板在4摄氏度下孵育15至20分钟，然后FRAP成像和分析。
在 FRAP 成像和分析之前，让板在 4 摄氏度下孵育 15 到 20 分钟。在成像设置上，选择 Argon/2 激光器的 514 纳米线，因为荧光标记的峰值激发为 512 纳米，峰值发射为 527 纳米。接下来，在激光控制窗口中，单击 Argon/2、458、477、488、514，然后单击待机按钮。
等待大约三分钟后，激光预热，单击"打开"按钮。然后将激光的激光功率设置为 100%，然后按 Enter。接下来，将激光线的传输设置为5%的显微镜上，转向计划-Apochromat 63倍放大1.40数值孔油目标。
通过显微镜目镜查看试样，并在视野的中心放置一个像诱导结构的诱导结构。然后，在采集软件中，将帧大小设置为 512 x 512 像素，扫描速度设置为 8，数据深度设置为 12 位。还将扫描平均值设置为 1，光学变焦设置为 3，然后按 Enter。
接下来，将针孔到 1.95 误差单元和探测器增益到 582，略低于饱和度。为图像采集创建一个方形区域，其尺寸为 150 x 150 像素。设置时间序列，以便对感兴趣的区域进行 35 次扫描，每 30 秒扫描一次。
然后，设置漂白剂控制，使光漂白将在扫描5号后发生，以收集五个预漂白图像的感兴趣区域。按 Enter 键进行确认。接下来，转到"漂白区域"窗口，在直径为 10 像素的聚集式诱导结构区域内创建一个圆形的漂白剂区域。
现在，将迭代次数设置为 300，然后再次按 Enter 键。然后，将激光线设置为 100% 功率，并在激光的传输百分比字段中输入 100，然后按 Enter。最后，运行图像采集程序，从10个小于3微米的漂移的细胞中收集10个聚集式诱导结构的FRAP数据。
要开始数据分析，请先将 AIM lsm 文件传输到个人计算机进行数据分析。通过使用图像处理程序打开每个 AIM lsm 文件，对齐或匹配感兴趣的采集区域的时间序列图像堆栈，纠正图像漂移。然后，选择插件、注册、StackReg 和翻译，然后选择插件、注册、StackReg，然后选择刚体。
接下来，设置兴趣管理器区域，测量感兴趣漂白区域的信号强度。为此，选择椭圆形工具，然后在感兴趣的漂白剂区域中绘制一个直径为 10 像素的圆圈，然后单击"添加"按钮。添加后，设置程序以测量目标控制区域的信号强度。
选择矩形工具，然后在控制区域中绘制 20 x 20 像素的正方形，然后单击"添加"按钮。最后，建立兴趣管理器区域，以测量感兴趣背景区域的信号强度。选择矩形工具，在背景区域中绘制 20 x 20 像素的正方形，然后单击"添加"按钮。
在 ROI 管理器中添加要分析的区域后，相应地重命名它们漂白 ROI、控制 ROI 和后台 ROI。测量每个区域的信号强度。为此，请选择漂白 ROI、控制 ROI 和后台 ROI，然后转到"更多"，然后选择"多度量值"。
将结果粘贴到电子表格中，分别标记为漂白 ROI、控制 ROI 和后台 ROI。首先，从标记为"漂白 ROI"的列中标记为"背景 ROI"的值和标记为"控制 ROI"的列中减去标记为"背景 ROI"的值，以及将列标记为"控制 ROI"的列中减去信号强度来校正"漂白 ROI"和控制 ROI 中的信号强度。标记这些新列校正漂白 ROI 和已更正控制 ROI。
接下来，将漂白 ROI 中的信号规范化为控制 ROI 中的背景校正信号。将标记为"已更正的漂白 ROI"列中的值除以标记为"已更正控制 ROI"的列中的值。标记此新列，规范化校正漂白 ROI。
然后，将规范化校正漂白 ROI 列中的信号规范化为漂白 ROI 中五个预漂白值的平均值。将标记为规范化校正漂白 ROI 的列中的值除以"漂白 ROI"中五个预漂白值的平均值。标记此新列，规范化校正预漂白平均漂白 ROI。
最后，打开一个图像处理程序。曲线通过复制漂白后规范化校正的漂白 ROI 值和相应的时间值，适合规范化和校正的漂白剂 ROI 数据。将它们粘贴到"曲线拟合器"窗口中，从"曲线拟合器"下拉菜单中选择指数恢复，然后选择"适合"。
此处显示的是使用 LPS 处理的 RAW264.7 细胞光漂白后荧光恢复的典型视频。在利益聚集式诱导结构区域内的荧光恢复缓慢。本实验使用光漂白来检查p62的机动性程度。
p62 荧光在聚集式诱导结构，预漂白和后漂白，如下所示。如本视频中所述，荧光强度可以随着时间的推移进行跟踪。在背景校正和规范化之后，p62荧光可以计算成移动分数的22%，不可移动分数为78%，并描述在类似聚集的诱导结构中恢复的一半，描述为2.14分钟。
请记住，正确定义感兴趣的收购区域尤为重要，以便它包括感兴趣的 ALIS、感兴趣的控制区域和感兴趣的背景区域。按照此过程，可以应用其他定量荧光显微镜技术，如光漂白、FLIP 和选择性光漂白中的荧光损耗。当FLIP测量亚细胞隔间之间的连续性和沟通程度时，选择性光漂白提供了蛋白质主动和被动地向细胞器或蛋白质丰富区域之间的动力学信息。
FRAP 最初旨在量化细胞膜中蛋白质的横向运动。随后，它被用来量化各种亚细胞隔间内部和之间的蛋白质流动性，为研究人员回答包括细胞和分子生物学、发育生物学、神经科学、材料科学、高级生物材料和药物发现在内的各个领域的问题铺平了道路。
