La récupération de fluorescence existante après photobleaching, protocoles FRAP, sont incomplètes ou trop complexes. Le protocole présenté dans cette vidéo est significatif en ce sens qu’il est complet, pratique et simple. Le principal avantage de cette technique FRAP est qu’elle permet la quantification de la mobilité protéique à l’intérieur et entre les compartiments subcellulaires dans les cellules vivantes.
Le FRAP est à l’étude à des fins thérapeutiques et diagnostiques. L’une de ces utilisations est de quantifier la diffusion dans les systèmes d’administration de médicaments dans différents tissus in vivo. Ces informations peuvent être utilisées pour optimiser la structure et la composition d’un médicament.
La technique de microscopie FRAP a permis de mieux comprendre un large éventail de domaines dans lesquels la compréhension du phénomène de diffusion est d’intérêt. Il s’agit notamment de la biologie cellulaire et moléculaire, de la biologie du développement, des neurosciences, des sciences des matériaux, des biomatériaux avancés et de la découverte de médicaments. Bien que le protocole décrit soit utilisé avec les cellules mammifères, les concepts peuvent être appliqués à d’autres systèmes, tels que les cellules végétales, les cellules de levure et les bactéries.
Une personne qui n’a jamais effectué cette technique peut avoir du mal à déterminer les paramètres optimaux d’acquisition d’image, à créer une région d’acquisition d’intérêt adaptée à son expérience et à calculer la fraction mobile et la mi-temps de récupération. Lorsque vous essayez cette procédure pour la première fois, assurez-vous d’effectuer plusieurs expériences pilotes pour optimiser le protocole dans le contexte des objectifs de votre expérience. Maleen Cabe, technicienne de mon laboratoire, et David Rademacher, le directeur principal de l’établissement d’imagerie, démontreront la procédure.
Pour commencer, préparez une plaque de macrophages RAW264.7 transfectés YFP-p62, et traitez-les avec lipopolysaccharide tel que décrit dans le protocole de texte qui l’accompagne. Ensuite, rincez les cellules traitées avec le tampon froid de Tyrode une fois. Ensuite, ajoutez deux millilitres de tampon tyrode complété par Nocodazole à la plaque, et laissez les plaques couver à quatre degrés Celsius pendant 15 à 20 minutes avant l’imagerie et l’analyse frap.
Laissez les plaques couver à quatre degrés Celsius pendant 15 à 20 minutes avant l’imagerie et l’analyse du FRAP. Lors de la configuration de l’imagerie, sélectionnez la ligne de 514 nanomètres du laser Argon/2, car le marqueur de fluorescence a une excitation maximale à 512 nanomètres, et une émission maximale à 527 nanomètres. Ensuite, dans la fenêtre de contrôle laser, cliquez sur Argon/2, 458, 477, 488, 514, puis cliquez sur le bouton veille.
Après avoir attendu environ trois minutes pour que le laser se réchauffe, cliquez sur le bouton On. Réglez ensuite la puissance laser du laser à 100% et appuyez sur Entrez. Ensuite, réglez la transmission de la ligne laser à 5% Sur le microscope, tournez-vous vers le Plan-Apochromat 63x grossissement 1,40 objectif d’huile d’ouverture numérique.
Visualisez le spécimen à travers l’oculaire du microscope et placez une structure induite en forme d’aggresome au centre du champ de vision. Ensuite, dans le logiciel d’acquisition, réglez la taille du cadre à 512 par 512 pixels, la vitesse d’analyse à huit, et la profondeur des données à 12 Bits. Réglez également la moyenne d’analyse à un, le zoom optique à trois, et appuyez sur Entrez.
Ensuite, se le sténopé à 1,95 unités d’erreur et le gain de détecteur à 582, qui est juste en dessous de la saturation. Créez une région d’intérêt en forme de carré pour l’acquisition de l’image, qui a les dimensions 150 par 150 pixels. Configurez la série de temps de telle sorte que la région d’intérêt est scannée 35 fois, une fois toutes les 30 secondes.
Ensuite, réglez le contrôle de l’eau de Javel de telle sorte que le photobleaching se produira après l’analyse numéro cinq, pour recueillir cinq images de pré-coupe de la région d’intérêt. Appuyez sur la clé Entrez pour confirmer. Ensuite, allez à la fenêtre Bleach Regions et créez une région d’eau de Javel de forme circulaire d’intérêt dans la zone de structure induite aggresome-like, qui a un diamètre de 10 pixels.
Maintenant, réglez le nombre d’itérations à 300, et appuyez à nouveau sur la clé Enter. Ensuite, réglez la ligne laser à 100% de puissance, et entrez 100 dans le champ de transmission pour cent pour le laser, et appuyez sur Entrez. Enfin, exécutez le programme d’acquisition d’images pour recueillir des données FRAP à partir de 10 structures induites de façon aggresome dans 10 cellules avec moins de trois microns de dérive.
Pour commencer l’analyse des données, transférez d’abord les fichiers AIM lsm à un ordinateur personnel pour analyse de données. Correction de la dérive de l’image en alignant ou en faisant correspondre la pile d’images de séries horaires de la région d’acquisition d’intérêt en ouvrant chaque fichier AIM lsm avec un programme de traitement d’image. Ensuite, sélectionnez Plugins, Registration, StackReg et Translation, puis sélectionnez Plugins, Registration, StackReg, puis Rigid Body.
Ensuite, mettre en place la région d’intérêt gestionnaire pour mesurer l’intensité du signal dans la région d’eau de Javel d’intérêt. Pour cela, sélectionnez l’outil ovale, puis dessinez un cercle dans la région d’eau de Javel d’intérêt avec un diamètre de 10 pixels, puis cliquez sur le bouton Ajouter. Une fois ajouté, mettre en place le programme pour mesurer l’intensité du signal dans la région de contrôle d’intérêt.
Sélectionnez l’outil rectangle, puis dessinez un carré de 20 par 20 pixels dans la région de contrôle, et cliquez sur le bouton Ajouter. Enfin, mettre sur place la région d’intérêt gestionnaire pour mesurer l’intensité du signal dans la région de fond d’intérêt. Sélectionnez l’outil rectangle, dessinez un carré de 20 par 20 pixels dans la région d’arrière-plan, puis cliquez sur le bouton Ajouter.
Après avoir ajouté les régions à analyser dans roi manager, renommez-les Bleach ROI, Control ROI, et Background ROI, en conséquence. Mesurer l’intensité du signal dans chaque région. Pour ce faire, sélectionnez Bleach ROI, Control ROI et Background ROI, puis passez à More et sélectionnez Multi Measure.
Coller les résultats à une feuille de calcul en colonnes étiquetées Bleach ROI, Control ROI et Background ROI, respectivement. Commencez par corriger l’intensité du signal dans le roi bleach et le retour sur investissement de contrôle en soustrayant les valeurs de la colonne étiquetée Retour sur investissement arrière des valeurs de la colonne étiquetée Bleach ROI, et la colonne étiquetée Control ROI. Étiquetez ces nouvelles colonnes Corrigé Bleach ROI et Correction du Retour sur investissement de contrôle.
Ensuite, normalisez le signal dans le roi bleach au signal corrigé en arrière-plan dans le roi de contrôle. Divisez les valeurs de la colonne étiquetée Roi d’eau de Javel corrigée par les valeurs de la colonne étiquetées Roi de contrôle corrigé. Étiquetez cette nouvelle colonne, Normalized Corrected Bleach ROI.
Ensuite, normalisez le signal dans la colonne normalisée de roi d’eau de Javel corrigée à la moyenne des cinq valeurs de pré-coupe dans le roi bleach. Divisez les valeurs de la colonne étiquetée Roi d’eau de Javel corrigée normalisée par la moyenne des cinq valeurs de pré-coupe dans le roi bleach. Étiquetez cette nouvelle colonne, Normalized Corrected Prebleach Average Bleach ROI.
Enfin, ouvrez un programme de traitement d’image. Curve s’adapte aux données normalisées et corrigées du roi de l’eau de Javel en copiant les valeurs normalisées de retour sur investissement corrigé de l’eau de Javel postbleach et les valeurs de temps correspondantes. Passez-les dans la fenêtre Curve Fitter, sélectionnez la récupération exponentielle du menu de dropdown Curve Fitter et sélectionnez Fit.
Montré ici est une vidéo typique de récupération de fluorescence après photobleaching pour RAW264.7 cellules traitées avec LPS. La récupération de fluorescence dans la région d’intérêt induite aggresome-like de structure, est lente. Cette expérience utilise le photobleaching pour examiner le degré de mobilité de p62.
p62 fluorescence dans les structures induites aggresome-like, prebleach et postbleach, est montré ici. Comme décrit dans cette vidéo, l’intensité de fluorescence peut être suivie au fil du temps. Après correction et normalisation de fond, la fluorescence p62 peut être calculée pour décrire la fraction mobile comme 22%la fraction immobile comme 78%et décrit la mi-temps de récupération dans les structures induites aggresome-like, comme 2.14 minutes.
N’oubliez pas qu’il est particulièrement important de bien définir la région d’acquisition d’intérêt afin qu’elle comporte un ALIS d’intérêt, une région de contrôle d’intérêt et une région d’intérêt de fond. Après cette procédure, d’autres techniques quantitatives de microscopie fluorescente peuvent être appliquées, telles que la perte de fluorescence dans le photobleaching, flip, et le photobleaching sélectif. Alors que flip mesure le degré de continuité et de communication entre compartiments subcellulaires, le photobleaching sélectif fournit des informations cinétiques sur le transport actif et passif des protéines dans les organites, ou entre les zones riches en protéines.
Frap a été initialement développé pour quantifier le mouvement latéral des protéines dans les membranes cellulaires. Par la suite, il a été utilisé pour quantifier la mobilité des protéines à l’intérieur et entre une variété de compartiments subcellulaires, ce qui a ouvert la voie aux chercheurs pour répondre à des questions dans une variété de domaines, y compris la biologie cellulaire et moléculaire, la biologie du développement, les neurosciences, les sciences des matériaux, les biomatériaux avancés et la découverte de médicaments.
