Il recupero della fluorescenza esistente dopo il fotobleaching, i protocolli FRAP, sono incompleti o estroppo complessi. Il protocollo presentato in questo video è significativo in quanto è completo, pratico e diretto. Il principale vantaggio di questa tecnica FRAP è che consente la quantificazione della mobilità proteica all'interno e tra i compartimenti subcellulari nelle cellule vive.
La FRAP è allo studio sia a fini terapeutici che diagnostici. Uno di questi usi è quantificare la diffusione all'interno dei sistemi di somministrazione dei farmaci in diversi tessuti in vivo. Queste informazioni possono essere utilizzate per ottimizzare una struttura e una composizione del farmaco.
La tecnica di microscopia FRAP ha fornito approfondimenti in un'ampia gamma di campi in cui la comprensione del fenomeno di diffusione è di interesse. Questi includono biologia cellulare e molecolare, biologia dello sviluppo, neuroscienze, scienza dei materiali, biomateriali avanzati e scoperta di farmaci. Sebbene il protocollo descritto sia per l'uso con cellule di mammiferi, i concetti possono essere applicati ad altri sistemi, come cellule vegetali, cellule di lievito e batteri.
Un individuo che non ha mai eseguito questa tecnica può avere difficoltà a determinare i parametri ottimali di acquisizione delle immagini, creare una regione di interesse di acquisizione adatta al proprio esperimento e calcolare la frazione mobile e l'intervallo di tempo di recupero. Quando si tenta questa procedura per la prima volta, assicurarsi di eseguire diversi esperimenti pilota per ottimizzare il protocollo nel contesto degli obiettivi dell'esperimento. A dimostrare la procedura saranno Maleen Cabe, un tecnico del mio laboratorio, e David Rademacher, il responsabile della struttura di imaging principale.
Per iniziare, preparare una lastra di macrofagi RAW264.7 trasfettato da YFP-p62 e trattarli con lipopolysaccharide come descritto nel protocollo di testo di accompagnamento. Quindi, sciacquare le cellule trattate con il tampone di Tyrode ghiacciato una volta. Quindi, aggiungere due millilitri del tampone del tirolo integrato con Nocodazolo alla piastra e lasciare che le piastre incubano a quattro gradi Celsius per 15-20 minuti prima dell'imaging e dell'analisi FRAP.
Lasciare che le piastre incubano a quattro gradi Celsius per 15-20 minuti prima dell'imaging e dell'analisi FRAP. Durante la configurazione dell'imaging, selezionare la linea di 514 nanometri del laser Argon/2, poiché il marcatore di fluorescenza ha un'eccitazione di picco a 512 nanometri e un'emissione di picco a 527 nanometri. Nella finestra Controllo laser fare clic su Argon/2, 458, 477, 488, 514 e quindi sul pulsante Standby.
Dopo aver atteso circa tre minuti per il riscaldamento del laser, fare clic sul pulsante On. Quindi impostare la potenza laser del laser sul 100% e premere INVIO. Successivamente, impostare la trasmissione della linea laser sul 5% Al microscopio, rivolgersi all'obiettivo dell'olio ad apertura numerica Plan-Apochromat 63x ingrandimento 1.40.
Guarda il campione attraverso l'oculare del microscopio e posiziona una struttura indotta simile a un aggresome al centro del campo visivo. Quindi, nel software di acquisizione, impostare la dimensione del fotogramma su 512 per 512 pixel, la velocità di scansione su otto e la profondità dei dati su 12 Bit. Impostare anche la media di scansione su uno, lo zoom ottico su tre e premere INVIO.
Successivamente, se il foro stenopeica a 1,95 unità di errore e il guadagno del rilevatore a 582, che è appena al di sotto della saturazione. Creare un'area di interesse a forma quadrata per l'acquisizione dell'immagine, con dimensioni 150 per 150 pixel. Impostare le serie temporali in modo che l'area di interesse viene scansionata 35 volte, una volta ogni 30 secondi.
Quindi, impostare il controllo della candeggina in modo che il fotobleaching avvenga dopo la scansione numero cinque, per raccogliere cinque immagini di prebleach della regione di interesse. Premere INVIO per confermare. Quindi, vai alla finestra Regioni candeggina e crea una regione di interesse della candeggina a forma circolare all'interno dell'area della struttura indotta simile a un aggresome, che ha un diametro di 10 pixel.
A questo punto, impostare il numero di iterazioni su 300 e premere nuovamente INVIO. Quindi, impostare la linea laser sul 100% di potenza, immettere 100 nel campo percentuale di trasmissione per il laser e premere INVIO. Infine, esegui il programma di acquisizione di immagini per raccogliere dati FRAP da 10 strutture indotte simili ad aggresome in 10 celle con meno di tre micron di deriva.
Per iniziare l'analisi dei dati, trasferire innanzitutto i file AIM lsm su un personal computer per l'analisi dei dati. Correggere la deriva dell'immagine allineando o abbinando la pila di immagini in serie temporali dell'area di interesse di acquisizione aprendo ogni file AIM lsm con un programma di elaborazione delle immagini. Quindi, selezionare Plugin, Registrazione, StackReg e Traduzione, seguito selezionando Plugin, Registrazione, StackReg e quindi Corpo rigido.
Successivamente, impostare il gestore della regione di interesse per misurare l'intensità del segnale nella regione di interesse della candeggina. Per questo, selezionare lo strumento ovale, quindi disegnare un cerchio nella regione di interesse della candeggina con un diametro di 10 pixel e quindi fare clic sul pulsante Aggiungi. Una volta aggiunto, impostare il programma per misurare l'intensità del segnale nella regione di controllo di interesse.
Selezionare lo strumento rettangolo, quindi disegnare un quadrato di 20 per 20 pixel nell'area del controllo e fare clic sul pulsante Aggiungi. Infine, istituire il gestore della regione di interesse per misurare l'intensità del segnale nella regione di interesse di fondo. Selezionare lo strumento rettangolo, disegnare un quadrato di 20 per 20 pixel nell'area di sfondo e quindi fare clic sul pulsante Aggiungi.
Dopo aver aggiunto le aree da analizzare in ROI Manager, rinominarle Bleach ROI, Control ROI e Background ROI, di conseguenza. Misurare l'intensità del segnale in ogni regione. A tale scopo, selezionare ROI candeggina, ROI controllo e ROI in background, quindi passare a Altro e selezionare Multi measure.
Incollare i risultati in un foglio di calcolo in colonne etichettate rispettivamente ROI candeggina, ROI controllo e ROI in background. Inizia con lo sfondo correggendo l'intensità del segnale nel ROI candeggina e il ROI del controllo sottraendo i valori nella colonna etichettati ROI sfondo dai valori nella colonna etichettata ROI candeggina e colonna etichettata ROI controllo. Etichettare queste nuove colonne Corretto Bleach ROI e Corretto Control ROI.
Successivamente, normalizza il segnale nel ROI Bleach al segnale corretto in background nel ROI di controllo. Dividere i valori nella colonna corretta ROI candeggina per i valori nella colonna con l'etichetta ROI controllo corretto. Etichettare questa nuova colonna, Normalized Corrected Bleach ROI.
Quindi, normalizza il segnale nella colonna ROI candeggina corretta normalizzata alla media dei cinque valori di prebleach nel ROI bleach. Dividere i valori nella colonna normalizzato corretto BLEACH ROI per la media dei cinque valori di prebleach nel ROI Candeggina. Etichettare questa nuova colonna, Normalized Corrected Prebleach Average Bleach ROI.
Infine, apri un programma per l'elaborazione delle immagini. La curva si adatta ai dati del ROI della candeggina normalizzati e corretti copiando i valori del ROI della candeggina corretti normalizzati postbleach e i corrispondenti valori di tempo. Incollateli nella finestra Ingombro curva (Curve Fitter), selezionate recupero esponenziale (Exponential Recovery) dal menu a discesa Attacco curva (Curve Fitter) e selezionate Adatta (Fit).
Ecco un tipico video di recupero della fluorescenza dopo il fotobleaching per le cellule RAW264.7 trattate con LPS. Il recupero della fluorescenza all'interno della regione di interesse della struttura indotta simile a un aggresome è lento. Questo esperimento utilizza il fotobleaching per esaminare il grado di mobilità di p62.
p62 fluorescenza nelle strutture indotte simili ad aggresome, prebleach e postbleach, è mostrato qui. Come descritto in questo video, l'intensità della fluorescenza può essere monitorata nel tempo. A seguito della correzione e normalizzazione dello sfondo, la fluorescenza p62 può essere calcolata per descrivere la frazione mobile come 22% la frazione immobile come 78%e descrive l'intervallo di recupero all'interno delle strutture indotte simili ad aggresome, come 2,14 minuti.
Ricorda, è particolarmente importante definire correttamente la regione di interesse di acquisizione in modo che includa un ALIS di interesse, una regione di controllo di interesse e una regione di interesse di fondo. Seguendo questa procedura, possono essere applicate altre tecniche quantitative di microscopia fluorescente, come la perdita di fluorescenza nel fotobleaching, FLIP e il fotobleaching selettivo. Mentre FLIP misura il grado di continuità e comunicazione tra i compartimenti subcellulari, il fotobleaching selettivo fornisce informazioni cinetiche sul trasporto attivo e passivo delle proteine negli organelli o tra aree ricche di proteine.
FRAP è stato inizialmente sviluppato per quantificare il movimento laterale delle proteine nelle membrane cellulari. Successivamente, è stato utilizzato per quantificare la mobilità proteica all'interno e tra una varietà di compartimenti subcellulari, il che ha spianato la strada ai ricercatori per rispondere alle domande in una varietà di campi, tra cui biologia cellulare e molecolare, biologia dello sviluppo, neuroscienze, scienza dei materiali, biomateriali avanzati e scoperta di farmaci.
