התאוששות פלואורסצנטיות קיימת לאחר פוטובלאצ'ים, פרוטוקולי FRAP, אינם שלמים או מורכבים מדי. הפרוטוקול המוצג בסרטון זה הוא משמעותי גם היטב, מעשי וישיר. היתרון העיקרי של טכניקת FRAP זו הוא שהיא מאפשרת כימות של ניידות חלבונים בתוך ובין תאים תת-תאיים בתאים חיים.
FRAP נחקר הן למטרות טיפוליות והן למטרות אבחון. שימוש אחד כזה הוא לכמת דיפוזיה בתוך מערכות אספקת תרופות ברקמות שונות ב vivo. מידע זה יכול לשמש כדי לייעל מבנה סמים והרכב.
טכניקת המיקרוסקופיה FRAP סיפקה תובנות במגוון רחב של תחומים שבהם הבנת תופעת ההתפזרות מעניינת. אלה כוללים ביולוגיה תאית ומולקולרית, ביולוגיה התפתחותית, מדעי המוח, מדעי החומר, ביו-חומרים מתקדמים וגילוי תרופות. למרות שהפרוטוקול המתואר הוא לשימוש עם תאי יונקים, ניתן להחיל את המושגים על מערכות אחרות, כגון תאי צמחים, תאי שמרים וחיידקים.
אדם שמעולם לא ביצע טכניקה זו עשוי להיאבק בקביעת הפרמטרים האופטימליים של רכישת תמונה, יצירת אזור רכישה מעניין שמתאים לניסוי שלהם, וחישוב החלק הנייד ומחצית ההחלמה. בעת ניסיון הליך זה בפעם הראשונה, הקפד לבצע מספר ניסויי פיילוט כדי לייעל את הפרוטוקול בהקשר של מטרות הניסוי שלך. הדגימו את ההליך יהיו מאלן קייב, טכנאי מהמעבדה שלי, ודיוויד רדמאכר, מנהל מתקן ההדמיה המרכזי.
כדי להתחיל, להכין צלחת של מקרופאגים YFP-p62 מגולפים RAW264.7, ולטפל בהם עם Lipopolysaccharide כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה. לאחר מכן, לשטוף את התאים המטופלים עם חיץ קר כקרח של טירודה פעם אחת. לאחר מכן, להוסיף שני מיליליטר של חיץ טירוד תוסף Nocodazole לצלחת, ולאפשר את הצלחות דגירה בארבע מעלות צלזיוס במשך 15 עד 20 דקות לפני הדמיה וניתוח FRAP.
אפשר את הצלחות דגירה בארבע מעלות צלזיוס במשך 15 עד 20 דקות לפני הדמיה וניתוח FRAP. מעל במערך ההדמיה, בחר את קו 514 ננומטר של לייזר ארגון /2, כמו סמן פלואורסצנטי יש עוררות שיא ב 512 ננומטר, ו פליטת שיא ב 527 ננומטר. לאחר מכן, בחלון בקרת לייזר, לחץ על ארגון/2, 458, 477, 488, 514 ולאחר מכן לחץ על לחצן המתנה.
לאחר המתנה של כשלוש דקות עד שהלייזר יתחמם, לחץ על לחצן ב. לאחר מכן הגדר את כוח הלייזר של הלייזר ל- 100% והקש Enter. לאחר מכן, הגדר את השידור של קו הלייזר ל 5%על המיקרוסקופ, לפנות Plan-Apochromat 63x הגדלה 1.40 צמצם צמצם המטרה.
הצג את הדגימה דרך עינית המיקרוסקופ והצב מבנה מושרה דמוי aggresome במרכז שדה המבט. לאחר מכן, בתוכנת הרכישה, הגדר את גודל המסגרת ל- 512 על 512 פיקסלים, את מהירות הסריקה לשמונה ואת עומק הנתונים ל- 12 סיביות. הגדר גם את ממוצע הסריקה לאחד, את גודל התצוגה האופטי לשלוש והקש Enter.
לאחר מכן, se חור הסיכה ל 1.95 יחידות שגיאה רווח גלאי ל 582, אשר ממש מתחת לרוויה. צור אזור מעניין בצורת ריבוע עבור רכישת התמונה, עם הממדים 150 על 150 פיקסלים. הגדר את סדרת הזמן כך שאזור העניין נסרק 35 פעמים, אחת ל-30 שניות.
לאחר מכן, להגדיר את בקרת אקונומיקה כך photobleaching יתרחש לאחר סריקה מספר חמש, כדי לאסוף חמש תמונות prebleach של האזור של עניין. הקש על מקש Enter כדי לאשר. לאחר מכן, עבור לחלון אזורי אקונומיקה וצור אזור אקונומיקה עגול של עניין בתוך אזור המבנה המושרה דמוי aggresome, כי יש קוטר של 10 פיקסלים.
כעת, הגדר את מספר איטראציות ל- 300 ולאחר מכן הקש שוב על מקש Enter. לאחר מכן, הגדר את קו הלייזר ל- 100%power והזן 100 בשדה אחוז השידור עבור הלייזר והקש Enter. לבסוף, הפעל את התוכנית לרכישת תמונות כדי לאסוף נתוני FRAP מ-10 מבנים מושרה דמויי aggresome ב-10 תאים עם פחות משלושה מיקרונים של סחף.
כדי להתחיל בניתוח נתונים, העבר תחילה את קבצי ה- LSM AIM למחשב אישי לצורך ניתוח נתונים. נכון להיסחף תמונה על ידי יישור או התאמה של ערימה של תמונות סדרת זמן של אזור הרכישה של עניין על ידי פתיחת כל קובץ LSM AIM עם תוכנית עיבוד תמונה. לאחר מכן, בחר תוספים, רישום, StackReg, ותרגום, ואחריו בחירת תוספים, רישום, StackReg, ולאחר מכן גוף נוקשה.
לאחר מכן, הקים את אזור מנהל העניין כדי למדוד את עוצמת האות באזור אקונומיקה של עניין. לשם כך, בחר בכלי אליפסה ולאחר מכן צייר עיגול באזור האקונומיקה המעניין בקוטר של 10 פיקסלים ולאחר מכן לחץ על לחצן הוסף. לאחר שנוספה, הגדר את התוכנית כדי למדוד את עוצמת האות באזור הבקרה של עניין.
בחרו בכלי מלבן, ולאחר מכן ציירו ריבוע של 20 על 20 פיקסלים באזור הבקרה ולחצו על הלחצן 'הוסף'. לבסוף, הגדר את אזור מנהל העניין כדי למדוד את עוצמת האות באזור הרקע של עניין. בחרו בכלי מלבן, ציירו ריבוע של 20 על 20 פיקסלים באזור הרקע ולחצו על הלחצן 'הוסף'.
לאחר הוספת האזורים שיש לנתח במנהל ההשקעות, שנה את שמם ל- Bleach ROI, Control ROI וההואריה ברקע, בהתאם. למדוד את עוצמת האות בכל אזור. כדי לבצע זאת, בחר באפשרות רוק ההשקעה של אקונומיקה, שלוט בההו על ההשקעה ובההובוי ההשקעה ברקע ולאחר מכן עבור אל עוד ובחר מולטי מידה.
הדבק את התוצאות בגיליון אלקטרוני בעמודות המסופות כ- Bleach ROI, Control ROI וההוצאה על ההשקעה ברקע, בהתאמה. התחל על-ידי תיקון עוצמת האות בהחזר על ההשקעה של Bleach וההחזר על ההשקעה על-ידי חיסור הערכים בעמודה המסווים כ- Background ROI מהערכים בעמודה בשם Bleach ROI והעמודה שכותרתה Control ROI. סמן את העמודות החדשות האלה כ-RoI של אקונומיקה מתוקנת וההפקדה תוקנה.
לאחר מכן, נרמל את האות בהוארי העבודה של Bleach לאות מתוקן ברקע בהו על ההשקעה של הבקרה. חלק את הערכים בעמודה המסווים כ- RoI של אקונומיקה מתוקנת לפי הערכים בעמודה שכותרתה תיקון הפקד ROI. סמן עמודה חדשה זו, תיקון מנורמל של תיקון ROI.
לאחר מכן, לנרמל את האות בעמודה תיקון מנורמל אקונומיקה ROI לממוצע של חמשת הערכים prebleach בהוארי אקונומיקה. חלק את הערכים בעמודה המסומתת כ- RoI של אקונומיקה מתוקנת מנורמלת בממוצע של חמשת ערכי ההקדמה בהחלקה ROI של Bleach. סמן עמודה חדשה זו, תיקון מנורמל מראש ממוצע האקונומיקה ROI.
לבסוף, פתח תוכנית לעיבוד תמונה. העקומה מתאימה את נתוני ROI הלבנה מנורמל ומתוקן על ידי העתקת postbleach מנורמל ערכי ROI הלבנה מתוקן וערכי הזמן המתאימים. הדביקו אותם בחלון 'מתאים עיקול', בחרו שחזור מעריכי מהתפריט הנפתח 'עיקול התאמה' ובחרו 'התאם'.
מוצג כאן הוא וידאו טיפוסי של התאוששות פלואורסצנטיות לאחר photobleaching עבור RAW264.7 תאים שטופלו LPS. התאוששות הפלואורסצנטיות בתוך אזור המבנה המושרה דמוי ההתבגרות של עניין, היא איטית. ניסוי זה משתמש פוטובלצ'ים כדי לבחון את מידת הניידות של p62.
p62 פלואורסצנטיות במבנים המושרים דמויי ההתמדה, prebleach ו postbleach, מוצג כאן. כפי שמתואר בסרטון זה, ניתן לעקוב אחר עוצמת הפלואורסצנטיות לאורך זמן. לאחר תיקון ונורמליזציה ברקע, ניתן לחשב את הפלואורסצנטיות p62 כדי לתאר את השבר הנייד כ-22% את השבר חסר התנועה כ-78% ומתאר את מחצית ההתאוששות בתוך המבנים המושרים דמויי ההאדרה, כ-2.14 דקות.
זכור, חשוב במיוחד להגדיר כראוי את אזור הרכישה של עניין, כך שהוא כולל ALIS של עניין, אזור שליטה של עניין, ואזור רקע של עניין. בעקבות הליך זה, ניתן ליישם טכניקות מיקרוסקופיות פלואורסצנטיות כמותיות אחרות, כגון אובדן פלואורסצנטיות בפוטובלאצ'ינג, FLIP וצילום סלקטיבי. בעוד FLIP מודד את מידת ההמשכיות והתקשורת בין תאים תת-תאיים, פוטובלאצ'ים סלקטיביים מספקים מידע קינטי על הובלה אקטיבית ופסיבית של חלבונים לאברונים, או בין אזורים עשירים בחלבון.
FRAP פותחה בתחילה כדי לכמת את התנועה השוטף של חלבונים בממברנות התא. לאחר מכן, נעשה בו שימוש לכימות ניידות חלבונים בתוך ובין מגוון תאים תת-תאיים, אשר סללו לחוקרים את הדרך לענות על שאלות במגוון תחומים, כולל ביולוגיה תאית ומולקולרית, ביולוגיה התפתחותית, מדעי המוח, מדעי החומר, ביו-חומרים מתקדמים וגילוי סמים.
