光漂白後の既存の蛍光回復は、FRAPプロトコルは不完全か過度に複雑です。このビデオで紹介するプロトコルは、包括的で実用的でわかりやすいという点で重要です。このFRAP技術の主な利点は、生細胞内および細胞内の細胞内の区画間のタンパク質移動度の定量化を可能にすることです。
FRAPは、治療と診断の両方の目的で研究されています。そのような使用の1つは、生体内の異なる組織における薬物送達システム内の拡散を定量化することです。この情報は、薬物の構造と組成を最適化するために使用することができます。
FRAP顕微鏡技術は、拡散現象の理解が関心のある幅広い分野での洞察を提供してきました。これらには、細胞生物学、分子生物学、発生生物学、神経科学、材料科学、先端バイオマテリアル、創薬などがあります。記載されているプロトコルは哺乳類細胞と共に使用されるが、その概念は植物細胞、酵母細胞、細菌などの他のシステムに適用することができる。
この手法を実行したことがない個人は、最適な画像取得パラメータを決定し、実験に適した対象の取得領域を作成し、回復のモバイルフラクションとハーフタイムを計算するのに苦労する可能性があります。この手順を初めて試す際には、実験の目的に合わせてプロトコルを最適化するために、いくつかの試験実験を行ってください。この手順のデモンストレーションは、私の研究室の技術者であるマリーン・ケイブと、イメージング施設の中核的なマネージャーであるデビッド・ラデマッハーです。
まず、YFP-p62トランスフェクションRAW264.7マクロファージのプレートを調製し、付随するテキストプロトコルに記載されているようにリポ多糖で処理します。次に、処理した細胞を氷冷タイロードのバッファーで1回リンスします。その後、ノコダゾールを添加したタイローデのバッファーを2ミリリットルプレートに加え、FRAPイメージングおよび分析の前にプレートを摂氏4度で15〜20分間インキュベートします。
FRAPのイメージングと分析の前に、プレートを摂氏4度で15〜20分間インキュベートします。イメージング設定では、蛍光マーカーが512ナノメートルでピーク励起し、527ナノメートルでピークエミッションを有するので、アルゴン/2レーザーの514ナノメートルラインを選択します。次に、レーザーコントロールウィンドウで、Argon/2、458、477、488、514をクリックし、スタンバイボタンをクリックします。
レーザーがウォームアップするまで約 3 分待った後、[オン] ボタンをクリックします。次に、レーザーのレーザーパワーを100%に設定し、Enterキーを押します。次に、レーザーラインの透過を5%に設定し、プラン・アポクロマート63倍倍率1.40数値開口油目的にします。
顕微鏡接眼を通して標本を見て、視野の中心にアグレソームのような誘導構造を置く。次に、取得ソフトウェアで、フレームサイズを512 x 512ピクセル、スキャン速度を8ピクセル、データ深度を12ビットに設定します。また、スキャン平均を 1 に設定し、光学ズームを 3 に設定して、Enter キーを押します。
次に、ピンホールを1.95エラーユニットに、検出器ゲインを582にして、飽和度をわずかに下回ります。サイズが 150 x 150 ピクセルの画像取得に対象となる四角形の領域を作成します。対象地域を 30 秒に 1 回、35 回スキャンできるように時系列を設定します。
次いで、スキャン番号5の後に光漂白が起こるように漂白制御を設定し、対象領域の5つのプレブリーチ画像を収集する。Enter キーを押して確定します。次に、[ブリーチ領域]ウィンドウに移動し、アグリソーム状の誘導構造領域内に目的の円形の漂白領域を作成します。
次に、反復回数を 300 に設定し、Enter キーを押します。次に、レーザーラインを100%の電力に設定し、レーザーの透過率フィールドに100と入力し、Enterキーを押します。最後に、画像取得プログラムを実行して、ドリフトの約3ミクロン未満の10個の細胞内の10個のアグレソーム状誘導構造からFRAPデータを収集する。
データ分析を開始するには、まず、データ分析のために、AIM lsm ファイルをパーソナル・コンピューターに転送します。各 AIM lsm ファイルを画像処理プログラムで開くことで、対象となる取得領域の時系列画像のスタックを整列または一致させることにより、画像ドリフトを補正します。次に、[プラグイン]、[登録]、[StackReg]、[翻訳] の順に選択し、[プラグイン]、[登録]、[StackReg]、[リジッド ボディ] の順に選択します。
次に、関心のあるブリーチ領域のシグナル強度を測定するために、関心のある領域マネージャを設定します。この場合は、楕円形ツールを選択し、直径 10 ピクセルの対象となるブリーチ領域に円を描き、[追加] ボタンをクリックします。追加したら、対象の制御領域の信号強度を測定するプログラムを設定します。
長方形ツールを選択し、コントロール領域に 20 x 20 ピクセルの正方形を描画し、[追加] ボタンをクリックします。最後に、関心のあるバックグラウンド領域のシグナル強度を測定するために、関心のある領域マネージャを設定します。四角形ツールを選択し、背景領域に 20 x 20 ピクセルの正方形を描画し、[追加] ボタンをクリックします。
ROI マネージャで分析する領域を追加した後、それに応じて[ブリーチ ROI]、[コントロール ROI]、[バックグラウンド ROI]の名前を変更します。各領域の信号強度を測定します。これを行うには、[ブリーチ ROI]、[コントロール ROI]、[バックグラウンド ROI] の順に選択し、[その他] に移動して、[マルチ メジャー] を選択します。
結果を、それぞれ [ブリーチ ROI]、[コントロール ROI]、および [背景 ROI] というラベルの列に貼り付けます。まず、Bleach ROI とコントロール ROI のラベルが付いた列の値から[背景 ROI]という列の値を減算し、コントロール ROI というラベルの列から、コントロール ROI というラベルの列から値を減算することで、Bleach ROI とコントロール ROI の信号強度をバックグラウンドで補正します。これらの新しい列にラベルを付け、漂白剤ROIと補正されたコントロールROIを修正しました。
次に、Bleach ROI の信号をコントロール ROI のバックグラウンド補正信号に正規化します。[補正された漂白剤 ROI] というラベルの列の値を、修正されたコントロール ROI というラベルの列の値で割ります。この新しい列に、正規化補正ブリーチ ROI というラベルを付けます。
次に、正規化補正ブリーチ ROI カラムのシグナルを、Bleach ROI の 5 つのプレブリーチ値の平均に正規化します。[正規化補正ブリーチ ROI] というラベルの列の値を、Bleach ROI の 5 つのプレブリーチ値の平均で割ります。この新しい列にラベルを付け、正規化補正済みプレブリーチ平均漂白剤ROI。
最後に、画像処理用のプログラムを開きます。曲線は、正規化された、補正された漂白剤 ROI データに適合し、正規化された後の正規化された漂白剤 ROI 値とそれに対応する時間値をコピーします。カーブ フィッター ウィンドウに貼り付け、[カーブ フィッター] ドロップダウン メニューから指数関数的な回復を選択し、[フィット] を選択します。
ここに示されているのが、LPSで処理されたRAW264.7細胞の光漂白後の蛍光回復の典型的なビデオである。凝集体様誘導構造領域内の蛍光回復は、遅い。この実験では、p62の移動度を調べるためにフォトブリーチを使用します。
凝集様誘導構造におけるp62蛍光、プレブリーチおよびポストブリュチが、ここに示されている。このビデオで説明したように、蛍光強度は時間の経過とともに追跡することができます。バックグラウンドでの補正と正規化の後、p62蛍光は、移動率を78%として22%非移動分率と表現し、アグレソーム状誘導構造内の回復のハーフタイムを2.14分として記述するために計算することができる。
関心のある ALIS、対象の制御領域、および関心のある背景領域を含む、対象の取得領域を適切に定義することが特に重要です。この手順に従って、他の定量的蛍光顕微鏡法、例えば、光漂白、FLIP、および選択的光漂白における蛍光損失を適用することができる。FLIPは細胞内区画間の連続性と通信の程度を測定するのに対し、選択的光漂白は、オルガネラへのタンパク質の能動的および受動的輸送、またはタンパク質が豊富な領域間の移動情報を提供する。
FRAPは、細胞膜中のタンパク質の横運動を定量化するために開発されました。その後、細胞内および細胞内の様々な区画間のタンパク質移動度を定量化し、細胞生物学、発生生物学、神経科学、材料科学、高度な生体材料、創薬など、さまざまな分野で質問に答える道を開きました。
