A recuperação da fluorescência existente após o fotobleaching, os protocolos FRAP, são incompletos ou excessivamente complexos. O protocolo apresentado neste vídeo é significativo por ser abrangente, prático e direto. A principal vantagem desta técnica FRAP é que ela permite a quantificação da mobilidade proteica dentro e entre compartimentos subcelulares em células vivas.
O FRAP está sendo estudado para fins terapêuticos e diagnósticos. Um desses usos é quantificar a difusão dentro de sistemas de distribuição de medicamentos em diferentes tecidos in vivo. Essas informações podem ser usadas para otimizar uma estrutura e composição de medicamentos.
A técnica de microscopia FRAP forneceu insights em uma ampla gama de campos nos quais a compreensão do fenômeno de difusão é de interesse. Estes incluem biologia celular e molecular, biologia do desenvolvimento, neurociência, ciência material, biomateriais avançados e descoberta de drogas. Embora o protocolo descrito seja para uso com células de mamíferos, os conceitos podem ser aplicados a outros sistemas, como células vegetais, células de levedura e bactérias.
Um indivíduo que nunca realizou essa técnica pode ter dificuldade em determinar os parâmetros ideais de aquisição de imagem, criando uma região de aquisição de interesse adequada para seu experimento, e calculando a fração móvel e o intervalo da recuperação. Ao tentar este procedimento pela primeira vez, certifique-se de realizar vários experimentos piloto para otimizar o protocolo no contexto dos objetivos do seu experimento. Demonstrando o procedimento estarão Maleen Cabe, um técnico do meu laboratório, e David Rademacher, o gerente do centro de imagens.
Para começar, prepare uma placa de macrófagos RAW264.7 transfectados YFP-p62 e trate-os com lipopolisacarida, conforme descrito no protocolo de texto que acompanha. Em seguida, enxágue as células tratadas com o tampão de Tyrode gelado uma vez. Em seguida, adicione dois mililitros do tampão de Tyrode complementado com Nocodazol à placa, e permita que as placas incubam a quatro graus Celsius por 15 a 20 minutos antes da imagem e análise frap.
Deixe as placas incubarem a quatro graus Celsius por 15 a 20 minutos antes da imagem e análise frap. Na configuração de imagem, selecione a linha de 514 nanômetros do laser argon/2, já que o marcador de fluorescência tem um pico de excitação em 512 nanômetros, e uma emissão máxima de 527 nanômetros. Em seguida, na janela laser control, clique em Argon/2, 458, 477, 488, 514 e clique no botão Standby.
Depois de esperar cerca de três minutos para o laser aquecer, clique no botão On. Em seguida, defina a potência laser do laser para 100% e pressione Enter. Em seguida, defina a transmissão da linha laser para 5% No microscópio, vire para o Plano-Apochromat 63x ampliação 1,40 objetivo de óleo de abertura numérica.
Veja o espécime através da ocular do microscópio e coloque uma estrutura induzida em forma de aggresome no centro do campo de visão. Em seguida, no software de aquisição, defina o tamanho do quadro para 512 por 512 pixels, a velocidade de varredura para oito e a profundidade de dados para 12 Bit. Também defina a média de varredura para um, o zoom óptico para três e pressione Enter.
Em seguida, se o pinhole para 1,95 unidades de erro e detector ganhar para 582, que está logo abaixo da saturação. Crie uma região de interesse em forma quadrada para a aquisição de imagens, que tem as dimensões de 150 por 150 pixels. Configure a série de tempo de tal forma que a região de interesse seja digitalizada 35 vezes, uma vez a cada 30 segundos.
Em seguida, defina o controle de alvejante de tal forma que o fotobleaching ocorrerá após a varredura número cinco, para coletar cinco imagens prebleach da região de interesse. Pressione a tecla Enter para confirmar. Em seguida, vá para a janela Regionais de Alvejante e crie uma região de alvejante em forma circular de interesse dentro da área de estrutura induzida em forma de aggresome, que tem um diâmetro de 10 pixels.
Agora, defina o número de iterações para 300 e pressione novamente a tecla Enter. Em seguida, defina a linha laser para 100% de potência, e digite 100 no campo percentual de transmissão para o laser, e pressione Enter. Finalmente, execute o programa de aquisição de imagens para coletar dados FRAP de 10 estruturas induzidas semelhantes a aggresome em 10 células com menos de três mícrons de deriva.
Para iniciar a análise de dados, primeiro transfira os arquivos AIM lsm para um computador pessoal para análise de dados. Corrija para deriva de imagem alinhando ou correspondendo à pilha de imagens de séries temporâneas da região de aquisição de interesse, abrindo cada arquivo AIM lsm com um programa de processamento de imagem. Em seguida, selecione Plugins, Registro, StackReg e Tradução, seguido de selecionar Plugins, Registro, StackReg e, em seguida, Corpo Rígido.
Em seguida, configure a região de gerente de interesse para medir a intensidade do sinal na região de interesse da alvejante. Para isso, selecione a ferramenta oval e, em seguida, desenhe um círculo na região de interesse alvejante com um diâmetro de 10 pixels e clique no botão Adicionar. Uma vez adicionado, configure o programa para medir a intensidade do sinal na região de controle de interesse.
Selecione a ferramenta retângulo e, em seguida, desenhe um quadrado de 20 por 20 pixels na região de controle e clique no botão Adicionar. Por fim, configure a região de gerente de interesse para medir a intensidade do sinal na região de fundo de interesse. Selecione a ferramenta retângulo, desenhe um quadrado de 20 por 20 pixels na região de fundo e clique no botão Adicionar.
Depois de adicionar as regiões a serem analisadas no ROI Manager, renomeie-as ROI de Alvejante, ROI de controle e ROI de fundo, em conformidade. Medir a intensidade do sinal em cada região. Para isso, selecione ROI de alvejante, ROI de controle e ROI de fundo e, em seguida, vá para Mais e selecione Multi Measure.
Cole os resultados em uma planilha em colunas rotuladas ROI de Alvejante, ROI de Controle e ROI de Fundo, respectivamente. Comece por segundo plano corrigindo a intensidade do sinal no ROI de Alvejante e no ROI de controle subtraindo os valores na coluna rotulada ROI de fundo dos valores da coluna rotulada ROI de Branqueamento, e a coluna rotulada de Controle ROI. Rotule essas novas colunas ROI de alvejante corrigido e ROI de controle corrigido.
Em seguida, normalize o sinal no ROI de alvejante para o sinal corrigido por fundo no ROI de controle. Divida os valores na coluna rotulada ROI de alvejante corrigido pelos valores da coluna rotulada ROI de controle corrigido. Rotule esta nova coluna, ROI de alvejante normalizado.
Em seguida, normalize o sinal na coluna ROI de alvejante normalizado para a média dos cinco valores de prebleach no ROI de Alvejante. Divida os valores na coluna rotulada ROI de alvejante corrigido normalizado pela média dos cinco valores de prebleach no ROI de Alvejante. Rotule esta nova coluna, Normalizada Corrigida Prebleach Média Alvejante ROI.
Por fim, abra um programa para processamento de imagens. A curva se encaixa nos dados de ROI de branqueamento normalizados e corrigidos copiando os valores de ROI de branqueamento normalizados e os valores de tempo correspondentes. Cole-os na janela Curve Fitter, selecione a recuperação exponencial do menu suspenso Do Curve Fitter e selecione Fit.
Mostrado aqui é um vídeo típico de recuperação de fluorescência após fotobleaching para células RAW264.7 tratadas com LPS. A recuperação da fluorescência dentro da região de interesse da estrutura induzida de aggresome é lenta. Este experimento usa fotobleaching para examinar o grau de mobilidade do p62.
p62 fluorescência nas estruturas induzidas aggresome-like, prebleach e postbleach, é mostrado aqui. Como descrito neste vídeo, a intensidade da fluorescência pode ser rastreada ao longo do tempo. Após a correção e normalização do plano de fundo, a fluorescência p62 pode ser calculada para descrever a fração móvel como 22% a fração imóvel como 78% e descreve o intervalo de recuperação dentro das estruturas induzidas semelhantes a aggresome, como 2,14 minutos.
Lembre-se, é especialmente importante definir adequadamente a região de aquisição de interesse para que inclua um ALIS de interesse, uma região de controle de interesse e uma região de fundo de interesse. Após este procedimento, outras técnicas de microscopia fluorescente quantitativa podem ser aplicadas, como perda de fluorescência em fotobleaching, FLIP e fotobleaching seletivo. Considerando que a FLIP mede o grau de continuidade e comunicação entre compartimentos subcelulares, o fotobleaching seletivo fornece informações cinéticas sobre o transporte ativo e passivo de proteínas em organelas, ou entre áreas ricas em proteínas.
O FRAP foi inicialmente desenvolvido para quantificar o movimento lateral das proteínas nas membranas celulares. Posteriormente, tem sido usado para quantificar a mobilidade proteica dentro e entre uma variedade de compartimentos subcelulares, o que abriu o caminho para os pesquisadores responderem a perguntas em uma variedade de campos, incluindo biologia celular e molecular, biologia do desenvolvimento, neurociência, ciência material, biomateriais avançados e descoberta de drogas.
