광표백 후 기존의 형광 복구, FRAP 프로토콜은 불완전하거나 지나치게 복잡합니다. 이 비디오에 제시된 프로토콜은 포괄적이고 실용적이며 간단하다는 점에서 중요합니다. 이 FRAP 기술의 주요 장점은 살아있는 세포내및 세포체 구획 사이의 단백질 이동성의 정량화를 허용한다는 것입니다.
FRAP는 치료 및 진단 목적으로 모두 연구되고 있습니다. 이러한 용도 중 하나는 생체 내의 다른 조직에서 약물 전달 시스템 내의 확산을 정량화하는 것입니다. 이 정보는 약물 구조 및 조성을 최적화하는 데 사용할 수 있습니다.
FRAP 현미경 기술은 확산 현상을 이해하는 것이 관심있는 필드의 넓은 범위에 있는 통찰력을 제공했습니다. 여기에는 세포 및 분자 생물학, 발달 생물학, 신경 과학, 재료 과학, 고급 생체 재료 및 약물 발견이 포함됩니다. 설명된 프로토콜은 포유류 세포와 함께 사용하기 위한 것이지만, 개념은 식물 세포, 효모 세포 및 박테리아와 같은 다른 시스템에 적용될 수 있다.
이 기술을 수행한 적이 없는 개인은 최적의 이미지 획득 매개 변수를 결정하고 실험에 적합한 관심 획득 영역을 만들고 모바일 분획 및 복구 하프타임을 계산하는 데 어려움을 겪을 수 있습니다. 이 절차를 처음 시도할 때는 실험 목표의 맥락에서 프로토콜을 최적화하기 위해 여러 파일럿 실험을 수행해야 합니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실의 기술자 인 말렌 카베와 핵심 이미징 시설 관리자 인 데이비드 라데마허 (David Rademacher)가 될 것입니다.
시작하려면, YFP-p62 의 플레이트를 전자 로264.7 대식세포로 준비하고, 동반 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 Lipopolysaccharide로 치료한다. 다음으로, 처리된 세포를 얼음 차가운 티로드의 버퍼로 한 번 헹구는 다. 그런 다음, 접시에 노코다졸 보충 티로의 버퍼의 두 밀리리터를 추가하고, FRAP 이미징 및 분석 전에 15 ~20 분 동안 4 섭씨에서 배양 플레이트를 허용합니다.
FRAP 이미징 및 분석 전에 플레이트가 섭씨 4도에서 15~20분 동안 배양하도록 허용합니다. 이미징 설정에서 형광 마커가 512 나노미터에서 피크 흥분을 가지고 527 나노미터에서 최대 방출을 하므로 Argon/2 레이저의 514 나노미터 라인을 선택하십시오. 다음으로 레이저 제어 창에서 Argon/2, 458, 477, 488, 514를 클릭한 다음 대기 버튼을 클릭합니다.
레이저가 따뜻해지도록 약 3분을 기다린 후 On 버튼을 클릭합니다. 그런 다음 레이저의 레이저 전력을 100 %로 설정하고 Enter를 누릅니다. 다음으로, 레이저 라인의 전송을 현미경으로 5%로 설정하고, 계획-아포크로마트 63x 배율 1.40 숫자 조리개 오일 목표를 설정한다.
현미경 접실을 통해 표본을 보고 시야의 중앙에 아그리솜과 같은 유도된 구조를 놓습니다. 그런 다음, 인수 소프트웨어에서 프레임 크기를 512 x 512 픽셀로 설정하고 스캔 속도를 8픽셀로 설정하고 데이터 깊이를 12비트로 설정합니다. 또한 스캔 평균을 1로 설정하고 광학 줌을 3으로 설정하고 Enter를 누릅니다.
다음으로 핀홀을 1.95 오차 단위로 세이고 검출기게는 582로 증가하여 채도 바로 아래에 있습니다. 크기 150 x 150 픽셀을 사용하는 이미지 수집에 대한 사각형 모양의 관심 영역을 만듭니다. 관심 영역을 30초마다 한 번씩 35번 스캔할 수 있도록 타임시리즈를 설정합니다.
이어서, 5번 스캔 후 광표백이 발생되도록 표백제 제어를 설정하고, 관심 영역의 5개의 프리블리치 영상을 수집한다. Enter 키를 눌러 확인합니다. 다음으로, 표백제 영역 창으로 이동하여 직경이 10픽셀인 응집형 유도 구조 영역 내에서 관심 있는 원형 형 표백제 영역을 만듭니다.
이제 반복 수를 300개로 설정하고 Enter 키를 다시 누릅니다. 그런 다음 레이저 라인을 100%의 전력으로 설정하고 레이저의 전송 퍼센트 필드에 100을 입력하고 Enter를 누릅니다. 마지막으로, 이미지 수집 프로그램을 실행하여 10개의 아그리솜 유도 구조로부터 10개의 개스미크론 미만의 드리프트를 수집합니다.
데이터 분석을 시작하려면 먼저 AIM lsm 파일을 개인용 컴퓨터로 전송하여 데이터 분석을 시작하십시오. 이미지 처리 프로그램과 각 AIM lsm 파일을 열어 관심 영역의 타임시리즈 이미지를 정렬하거나 일치시켜 이미지 드리프트에 적합합니다. 그런 다음 플러그인, 등록, StackReg 및 번역을 선택한 다음 플러그인, 등록, StackReg 및 강체를 선택합니다.
다음으로, 관심 있는 지역의 신호 강도를 측정하기 위해 관심 관리자 영역을 설정합니다. 이를 위해 타원형 도구를 선택한 다음 직경 10픽셀의 표백제 영역에 원을 그린 다음 추가 단추를 클릭합니다. 추가되면 관심 제어 영역에서 신호 강도를 측정하기 위해 프로그램을 설정합니다.
사각형 도구를 선택한 다음 컨트롤 영역에서 20x20픽셀의 정사각형을 그린 다음 추가 단추를 클릭합니다. 마지막으로 관심 영역의 신호 강도를 측정하기 위해 관심 관리자 영역을 설정합니다. 사각형 도구를 선택하고 백그라운드 영역에서 20x20픽셀의 정사각형을 그린 다음 추가 단추를 클릭합니다.
ROI 관리자에서 분석할 영역을 추가한 후 표백제 ROI, 제어 ROI 및 배경 ROI의 이름을 변경합니다. 각 영역에서 신호 강도를 측정합니다. 이를 수행하려면 표백제 ROI, 제어 ROI 및 배경 ROI를 선택한 다음 더 많은 것으로 이동한 다음 다중 측정값을 선택합니다.
결과를 스프레드시트에 블리치 ROI, 제어 ROI 및 배경 ROI라고 표시된 열에 각각 붙여 넣습니다. 표백제 ROI 및 제어 ROI의 신호 강도를 백그라운드로 수정하여 배경 으로 표시된 열의 값에서 배경 ROI로 레이블이 지정된 컬럼의 값과 표지된 컨트롤 ROI의 값에서 구색을 뺍니다. 이 새로운 열에 레이블을 지정하여 표백제 ROI를 수정하고 보정된 제어 ROI를 수정했습니다.
다음으로, 표백제 ROI의 신호를 제어 ROI에서 배경 보정 신호로 정규화한다. 보정된 표백제 ROI라고 표시된 열의 값을 보정된 제어 ROI라는 열의 값으로 나눕니다. 이 새 열에 레이블을 지정, 정규화 된 표백제 ROI.
그런 다음, 정규화된 표백제 ROI 컬럼의 신호를 표백제 ROI의 5개의 프리블리치 값의 평균으로 정규화한다. 정규화된 표백제 ROI라고 표시된 열의 값을 표백제 ROI의 5개 프리블리치 값의 평균으로 나눕니다. 이 새 열에 레이블을 지정, 정규화 된 정표백 전 표백제 평균 표백제 ROI.
마지막으로 이미지 처리를 위한 프로그램을 엽니다. 커브는 표백제 후 정규화된 표백제 ROI 값과 해당 시간 값을 복사하여 정규화 및 수정된 표백제 ROI 데이터에 맞습니다. 커브 피터 창에 붙여넣고 곡선 피터 드롭다운 메뉴에서 기하급수적 복구를 선택하고 맞춤을 선택합니다.
여기에 LPS로 처리된 RAW264.7 세포에 대한 광표백 후 형광 회복의 전형적인 비디오입니다. 응집과 같은 유도된 구조 영역 내의 형광 회복은 느리다. 이 실험은 포토표백을 사용하여 p62의 이동성 정도를 검사합니다.
접합과 유사한 유도 된 구조, 프리 블리치 및 포스트 표백제에서 p62 형광은 여기에 도시된다. 이 비디오에 설명된 바와 같이, 형광 강도는 시간이 지남에 따라 추적될 수 있다. 배경 보정 및 정규화에 따라 p62 형광은 이동 분획을 78%로 22%로 설명하기 위해 계산할 수 있으며, 2.14분으로 응집형 유도 구조 내에서 회복의 하프타임을 설명한다.
관심 있는 ALIS, 관심 영역 및 관심 영역을 포함하도록 관심 획득 영역을 적절하게 정의하는 것이 특히 중요합니다. 이 절차에 이어, 광표백, 플립 및 선택적 광표백에서형손실과 같은 다른 정량형 형광 현미경 기술이 적용될 수 있다. FLIP는 세포전구 간 연속성과 통신 정도를 측정하는 반면, 선택적 광표백은 단백질을 세포기관으로 활성 및 수동적으로 운반하는 운동 정보를 제공하거나 단백질이 풍부한 영역 간을 제공합니다.
FRAP는 세포막에 있는 단백질의 측면 운동을 정량화하기 위하여 처음에 개발되었습니다. 그 후, 세포 및 분자 생물학, 발달 생물학, 신경 과학, 물질 과학, 고급 생체 재료 및 약물 발견을 포함한 다양한 분야에서 연구원이 질문에 대답할 수있는 길을 열어 준 다양한 세포 형구 안팎의 단백질 이동성을 정량화하는 데 사용되었습니다.
