Существующее восстановление флуоресценции после фотоблейлинга, протоколы FRAP, являются либо неполными, либо чрезмерно сложными. Протокол, представленный в этом видео, имеет важное значение в том смысле, что он является всеобъемлющим, практичным и простым. Основным преимуществом этого метода FRAP является то, что он позволяет количественной оценки подвижности белка внутри и между подклеточными отсеками в живых клетках.
FRAP изучается как в терапевтических, так и в диагностических целях. Одним из таких методов использования является количественная оценка диффузии в системах доставки лекарств в различных тканях in vivo. Эта информация может использоваться для оптимизации структуры и состава препарата.
Метод микроскопии FRAP дает представление в широком диапазоне областей, в которых понимание явления диффузии представляет интерес. К ним относятся клеточная и молекулярная биология, биология развития, неврология, материаловедения, передовые биоматериалы и открытие лекарств. Хотя описанный протокол для использования с клетками млекопитающих, концепции могут быть применены к другим системам, таким как растительные клетки, дрожжевые клетки и бактерии.
Лицо, которое никогда не выполняло этот метод, может бороться в определении оптимальных параметров приобретения изображения, создании области приобретения, которая представляет интерес для их эксперимента, и расчете мобильной фракции и перерыве восстановления. При попытке этой процедуры в первый раз, не забудьте выполнить несколько экспериментальных экспериментов по оптимизации протокола в контексте целей вашего эксперимента. Демонстрация процедуры будет Малин Кейб, техник из моей лаборатории, и Дэвид Rademacher, основной менеджер объекта визуализации.
Для начала подготовь тарелку YFP-p62 трансфицированных макрофагов RAW264.7 и обработайте их липополисахаридом, как описано в сопроводительном текстовом протоколе. Затем, промыть обработанные клетки с буфером ледяной Тирод один раз. Затем добавьте два миллилитров буфера Тирода, дополненного нокодазолом, и позвольте пластинам инкубировать при четырех градусах Цельсия в течение 15-20 минут до получения и анализа FRAP.
Разрешить пластин инкубировать при четырех градусах по Цельсию в течение 15 до 20 минут до FRAP изображений и анализа. При установке изображений выберите 514 нанометровую линию лазера Argon/2, так как маркер флуоресценции имеет пик возбуждения на 512 нанометров и пиковое излучение на 527 нанометров. Далее, в окне лазерного управления, нажмите Argon/2, 458, 477, 488, 514, а затем нажмите кнопку Ожидания.
После ожидания около трех минут для лазера, чтобы согреться, нажмите кнопку On. Затем установите лазерную мощность лазера до 100% и нажмите Enter. Далее установите передачу лазерной линии до 5%На микроскопе поверните к плану-апохромату 63x увеличению 1,40 числовой цели масла диафрагмы.
Просмотр образца через микроскоп окуляр и место aggresome-как индуцированной структуры в центре поля зрения. Затем, в программном обеспечении приобретения, установите размер кадра до 512 на 512 пикселей, скорость сканирования до восьми, а глубину данных до 12 бит. Также установите среднее значение сканирования до одного, оптический зум до трех и нажмите Enter.
Далее, se pinhole до 1.95 единиц ошибки и детектор получить до 582, что чуть ниже насыщения. Создайте квадратную область, интересную для получения изображения, которая имеет размеры 150 на 150 пикселей. Настройка тайм-ряда таким образом, чтобы область интереса сканировалась 35 раз, один раз в 30 секунд.
Затем установите контроль отбеливателя таким образом, чтобы фотоотбелы происходили после сканирования номер пять, чтобы собрать пять предотливных изображений области интереса. Нажмите клавишу Enter, чтобы подтвердить. Далее перейдите к окну Bleach Regions и создайте круговую область отбеливателя, представляющий интерес в области aggresome-как индуцированная структура, которая имеет диаметр 10 пикселей.
Теперь установите количество итераций до 300 и снова нажмите клавишу Enter. Затем установите лазерную линию до 100% мощности, и введите 100 в области передачи процентов для лазера, и нажмите Enter. Наконец, запустите программу получения изображений для сбора данных FRAP из 10 аггресомных индуцированных структур в 10 ячейках с менее чем тремя микронами дрейфа.
Чтобы начать анализ данных, сначала перенесите файлы AIM lsm на персональный компьютер для анализа данных. Правильно для дрейфа изображений путем выравнивания или сопоставления стек изображений тайм-ряда области приобретения, представляющих интерес, открыв каждый файл AIM lsm с программой обработки изображений. Затем выберите плагины, регистрацию, StackReg и перевод, а затем выберите плагины, регистрацию, StackReg, а затем Rigid Body.
Далее, создать регион интересов менеджера для измерения интенсивности сигнала в области отбеливателя интересов. Для этого выберите овальный инструмент, затем нарисуйте круг в области отбеливателя, представляющий интерес с диаметром 10 пикселей, а затем нажмите кнопку Добавить. После добавления, создать программу для измерения интенсивности сигнала в области контроля интересов.
Выберите инструмент прямоугольника, затем нарисуйте квадрат 20 на 20 пикселей в области управления и нажмите кнопку Добавить. Наконец, создать регион интересов менеджера для измерения интенсивности сигнала в фоновом регионе, представляющих интерес. Выберите инструмент прямоугольника, нарисуйте квадрат 20 на 20 пикселей в фоновом режиме, а затем нажмите кнопку Добавить.
После добавления регионов, которые будут проанализированы в ROI Manager, переименуйте их в ROI Bleach, Control ROI и Background ROI соответственно. Измерьте интенсивность сигнала в каждом регионе. Для достижения этой цели выберите рентабельность инвестиций bleach, рентабельность инвестиций управления и справочную рентабельность инвестиций, а затем перейдите в More и выберите Multi Measure.
Вставьте результаты в электронную таблицу в столбцы с пометкой BLEACH ROI, Control ROI и Background ROI соответственно. Начните с фоновой коррекции интенсивности сигнала в рентабельности инвестиций Bleach и ROI Control, вычитая значения в столбце, помеченные Фоновой рентабельностью инвестиций, из значений в столбце с пометкой Bleach ROI и столбца с пометкой Control ROI. Наклеить этикетку на эти новые столбцы Исправлена рентабельность инвестиций bleach и исправлена рентабельность инвестиций в управление.
Далее нормализуется сигнал в рентабельности инвестиций bleach к фоновому коррекции сигнала в рентабельности управления. Разделите значения в столбце, помеченные исправленной рентабельностью инвестиций Bleach, значениями в столбце, помеченными Исправленной рентабельностью управления. Наклеить этикетку на эту новую колонку, нормализованную исправленную рентабельность инвестиций bleach.
Затем нормализует сигнал в нормализованной исправленной колонке окупаемости bleach в среднем до пяти значений преблейга в рентабельности инвестиций Bleach. Разделите значения в столбце с пометкой Нормализованная исправленная рентабельность инвестиций bleach в среднем на пять значений преблейга в рентабельности инвестиций Bleach. Наклеить этикетку на эту новую колонку, нормализованную исправленную среднюю рентабельность инвестиций в отбеливание Prebleach.
Наконец, откройте программу для обработки изображений. Кривая соответствует нормализованным и исправленным данным roi bleach путем копирования нормализованных исправленных значений рентабельности инвестиций отбеливателя и соответствующих значений времени. Вставьте их в окно Curve Fitter, выберите экспоненциальное восстановление из меню высадки Curve Fitter и выберите Fit.
Здесь показано типичное видео восстановления флуоресценции после фотоотливов для клеток RAW264.7, обработанных LPS. Восстановление флуоресценции в пределах aggresome-как индуцированной структуры области интереса, медленно. В этом эксперименте используется фотоотлив для изучения степени подвижности p62.
p62 флуоресценция в аггресомоподобных индуцированных структурах, преблейхе и постблехе, показана здесь. Как описано в этом видео, интенсивность флуоресценции можно отслеживать с течением времени. После коррекции фона и нормализации, флуоресценция p62 может быть рассчитана, чтобы описать мобильную фракцию как 22%-ную недвижимую долю как 78% и описывает перерыв восстановления в аггремоподобных индуцированных структурах, как 2,14 минуты.
Помните, что особенно важно правильно определить область приобретения, представляющий интерес, так что она включает в себя ALIS интересов, контрольный регион, представляющий интерес, и фоновый регион, представляющий интерес. После этой процедуры могут применяться другие количественные методы флуоресцентной микроскопии, такие как потеря флуоресценции при фотоотбеле, FLIP и селективном фотоотбеле. В то время как FLIP измеряет степень непрерывности и связи между субклеточными отсеками, селективное фотоотлив обеспечивает кинетическую информацию об активной и пассивной транспортировке белков в органеллы или между богатыми белками областями.
FRAP был первоначально разработан для количественной оценки бокового движения белков в клеточных мембранах. Впоследствии он был использован для количественной оценки подвижности белка внутри и между различными подклеточными отсеками, которые проложили путь для исследователей, чтобы ответить на вопросы в различных областях, включая клеточной и молекулярной биологии, биологии развития, неврологии, материаловедения, передовых биоматериалов, и открытие наркотиков.
