这种方法为传统的模拟方法提供了获得氨基酸超生产器的高效替代方案。该技术通过同时提供精度、灵敏度和高吞吐量，比传统的基于模拟的方法更上一种。该方法为理解氨基酸生产强度和稀有龙子的转化提供了新的依据，从理论上可以应用于所有微生物。
该协议主要依靠基本的分子实验操作，这些操作易于遵循，但可能需要多次试验，以实现应变应变的合适选择。该技术的视觉演示提供了对选择和筛选系统在识别氨基酸生产者方面的性能的直接了解。要开始此过程，请将矢量添加到标记片段中，在冰上，以一比一比七点五微升的装配混合到总体积十微升的摩尔比。
在50摄氏度下孵育一小时。在 42 摄氏度下将装配产品的 5 微升转换为 50 微升组件单元，使用 30 秒。在37摄氏度下用卡塔博利特抑制介质恢复超级最佳肉汤中的细胞一小时。
然后，在LB Agar介质上盘，在37摄氏度下孵育过夜。第二天，使用首选的商业套件来隔离质粒。首先，用一个微升质粒，携带野生型KanR，转化50微升的称职细胞。
用含有KanR RC 29的质粒转换第二组称职细胞，所有白氨酸编码素被稀有的codon CTA所取代。像文本协议中概述的培养细胞和孵育细胞培养。接下来，将含有野生型选择标记基因的菌落分别转移到五毫升的五毫升稀释LB介质中，每毫升浓度为50微克。
在 37 摄氏度的摇床中孵育样品，同时在 250 rpm 时摇动。然后，在定义的时间点将每个细胞培养物的 200 微升转移到 96 井板中。使用板读卡器测量 OD600。
在含有卡那霉素的两组五毫升的 0.2 x LB 介质中接种含有 KanR RC 29 标记基因的污渍，带或不供应 L-leucine。将 L-leucine 添加到其中一个介质中，最终浓度为每升一克。在 37 摄氏度的摇床中孵育样品，在 250 rpm 时摇动，并在确定的时间点测量每个培养的 OD600。
首先，用一种携带野生型GP或野生型PPG的质粒的微升来转化用于突变的父株的50微升。板和孵育的细胞培养，如文本协议中概述。接下来，将菌落单独转移到正确稀释的 LB 介质的五毫升。
在 37 摄氏度的摇床中孵育样品，在 250 rpm 时摇动。对于荧光标记，在定义的时间点将 200 微升的细胞培养物转移到 96 个清晰、清晰的底部背板中。测量荧光中的OD600并计算荧光强度。
对于色度标记，测量细胞培养物的颜色发展。执行如前所述的进料测定，测量荧光强度或定义时间点的颜色发展。首先，使用携带选择标记KanR RC 29或筛选标记GFP RC或PPG RC的质粒的一微升，转换突变细胞的50微升。接下来，将细胞培养物在4000倍G下离心5分钟。
对于选择，丢弃上一提液，并将含有卡那霉素的五毫升 0.2 x LB 介质添加到携带选择标记的细胞中。在37摄氏度的摇床中孵育样品过夜。第二天，将隔夜培养盘上含有卡那霉素的0.2 x LB汞培养基，并在37摄氏度下孵育12小时。
对于筛查，将装有筛查标记的合适数量的细胞板到含有适当抗生素的LB agar介质上。在37摄氏度下孵育8小时。在此之后，接种含有适当抗生素的LB介质与每个单组从板。
在 37 摄氏度的摇床中孵育样品，同时在 250 rpm 时摇动。测量OD600和荧光，并计算荧光强度，如果使用GGFP RC。如果使用 PPG RC，测量细胞培养物的颜色发展。
为了验证候选菌株的氨基酸成分，通过接种5毫升LB培养基来准备种子培养，每个候选菌株在250转/分和37摄氏度的摇床中过夜。第二天，在4000次G离心两分钟，从细胞培养的一毫升中收获细胞。丢弃上一杯，用一毫升无菌水重新暂停调色板。
接种含有4%葡萄糖的M9介质20毫升，用200微升细胞悬浮液，在250毫升的摇床中孵育，转速为250 rpm，在37摄氏度下孵育24小时。第二天，将培养介质的一毫升在4000倍G下离心5分钟。将 200 微升的上清液转移到干净的 1.5 毫升管中。
以此处所示的浓度准备 L-leucine 标准溶液。在烟罩中，在上流液和标准中加入100微升一毫摩尔三乙胺和100微升一摩尔苯甲氧乙烷。轻轻混合溶液，在室温下孵育一小时。
然后，将400微升的n-hexane加入同一管，然后旋涡10秒。下相包含氨基酸衍生物，用于HPLC分析。通过0.2微升聚四氟乙烯膜过滤下相。
在此之后，在配备 C18 柱的超 HPLC 上运行一微升样品，流速为每分钟 0.42 毫升，柱温为 40 摄氏度。使用二极管阵列检测器检测 254 纳米的靶向氨基酸，并绘制标准曲线下的峰值区域，计算其浓度。在这项研究中，使用罕见的富含共分的标记物来识别氨基酸超产剂，同时实现精度、灵敏度和高通量。
对于选择系统，与野生型菌株相比，对含有稀有富含可发性抗生素耐药基因的菌株，应观察到OD600的急剧下降。对蛋白质表达的罕见蛋白的抑制大多发生在饥饿条件下。在额外喂养相应的氨基酸后，OD600为菌株，为含有罕见的富含可糖的抗生素耐药基因显著增加。
在筛选系统中，荧光细胞数量中的荧光强度明显低于野生基因，即表达来自稀有富含科登基因的荧光蛋白的菌株。喂养相应的氨基酸将恢复蛋白质表达从罕见的富含科登的基因。使用紫色蛋白质时，从稀有富含共分的PPG中发展出的颜色比野生型基因的颜色要轻。
未稀释的LB介质允许缓慢的表达罕见的富含共生丰富的PPG，没有L-leucine喂养在表达的紫色蛋白质变得可见，一旦细胞被造粒。然而，这并不掩盖这样一个事实，即通过喂养L-leucine，从罕见的富含糖的PPG的基因表达得到加强。罕见的基于科登的策略可以识别突变库中目标氨基酸的超产，这些突变体应产生比父菌株更多的靶向氨基酸。
在尝试此程序时，必须调整稀有的 codon 频率，以实现在含有野生型标记的细胞和稀有的 codon 丰富的衍生物的细胞之间的 OD 或颜色上实现明显的区分。转录组分析和基因组测序可应用于选定的菌株，以研究与氨基酸生产相关的机制。利用这项技术，可以有效地识别氨基酸超产者，分析其遗传信息将提供新的见解，了解其背后的机制氨基酸过剩生产。
氨基酸衍生可能是有害的。确保戴上手套和防护服，并在烟罩中执行这些步骤。
