Questo metodo fornisce un'alternativa efficiente all'approccio convenzionale basato sull'analogico nell'ottenere sovraproduttori di amminoacidi. Questa tecnica sovracompia il metodo tradizionale basato sull'analogico fornendo precisione, sensibilità e alta produttività contemporaneamente. Questo metodo getta nuova luce sulla comprensione dei punti di forza della sovrapproduzione degli amminoacidi e sulla traduzione di codoni rari e potrebbe, teoricamente, essere applicato a tutti i microrganismi.
Questo protocollo si basa principalmente su operazioni sperimentali molecolari di base che sono facili da seguire, ma possono richiedere più prove al fine di ottenere l'adeguata selezione di stringenze di sforzo. Una dimostrazione visiva di questa tecnica offre un apprezzamento diretto sulle prestazioni della selezione e un sistema di screening nell'identificazione dei produttori di amminoacidi. Per iniziare questa procedura, aggiungere il vettore nei frammenti marcatori, sul ghiaccio, in un rapporto molare da uno a uno a sette punti cinque microlitri di mix di assemblaggio a un volume totale di dieci microlitri.
Incubare a 50 gradi Celsius per un'ora. Trasforma cinque microlitri del prodotto di assemblaggio in 50 microlitri di cellule componenti a 42 gradi Celsius per 30 secondi. Recupera le cellule in brodo Super Optimal con mezzo di repressione catabolita a 37 gradi Celsius per un'ora.
Quindi, placcarli sul mezzo LB Agar e incubare durante la notte a 37 gradi Celsius. Il giorno dopo, usa un kit commerciale preferito per isolare il plasmide. In primo luogo, trasformare 50 microlitri delle cellule competenti con un microlitro di plasmide che trasporta il KanR di tipo selvaggio.
Trasformare un secondo set di cellule competenti con il plasmide contenente KanR RC 29 con tutti i codoni leucina sostituiti dal raro codone CTA. Placcare e incubare la coltura cellulare come delineato nel protocollo di testo. Successivamente, trasferire le colonie che ospitano il gene marcatore di selezione di tipo selvatico nella derivata ricca di codone raro individualmente in cinque millilitri di mezzo LB diluito cinque volte contenente kanamicina ad una concentrazione di 50 microgrammi per millilitro.
Incubare i campioni in uno shaker a 37 gradi Celsius mentre si trema a 250 giri/min. Quindi, trasferire 200 microlitri di ciascuna delle colture cellulari in una piastra di 96 pozzi in triplice copia in punti di tempo definiti. Utilizzare un lettore di lastre per misurare l'OD600.
Inoculare le macchie che ospitano il gene marcatore KanR RC 29 in due insiemi di cinque millilitri del mezzo 0,2 x LB che contiene kanamicina, con o senza una fornitura di L-leucina. Aggiungere L-leucina a uno dei supporti a una concentrazione finale di un grammo per litro. Incubare i campioni in uno shaker a 37 gradi Celsius con scuotimento a 250 giri/min e misurare l'OD600 per ogni coltura in punti di tempo definiti.
Per iniziare, trasformare 50 microlitri del ceppo genitore utilizzato per la mutagenesi con un microlitro di plasmide che trasporta la GFP di tipo selvatico o il PPG di tipo selvatico. Placcare e incubare le impostazioni cultura delle celle come delineato nel protocollo di testo. Successivamente, trasferire le colonie singolarmente a cinque millilitri del mezzo LB correttamente diluito.
Incubare i campioni in uno shaker a 37 gradi Celsius con tremori a 250 giri/min. Per i marcatori di fluorescenza, trasferire 200 microlitri delle colture cellulari in una piastra posteriore inferiore ben chiara in triplice copia in punti di tempo definiti. Misurare l'OD600 nella fluorescenza e calcolare l'intensità della fluorescenza.
Per i marcatori cromogenici, misurare lo sviluppo del colore delle colture cellulari. Eseguire il saggio di alimentazione come descritto in precedenza e misurare l'intensità della fluorescenza o lo sviluppo del colore in punti di tempo definiti. In primo luogo, trasformare 50 microlitri delle cellule mutanti con un microlitro del plasmide che trasporta il marcatore di selezione KanR RC 29, o i marcatori di screening GFP RC o PPG RC. Quindi, centrifugare le colture cellulari a 4000 volte G per cinque minuti.
Per la selezione, scartare il supernatante e aggiungere cinque millilitri di mezzo 0,2 x LB contenente kanamicina alle celle che trasportano il marcatore di selezione. Incubare il campione durante la notte in uno shaker a 37 gradi Celsius. Il giorno successivo, placcare la coltura notturna su un supporto di agar 0,2 x LB contenente kanamicina e incubare a 37 gradi Celsius per 12 ore.
Per lo screening, placcare il numero appropriato di cellule che ospitano il marcatore di screening sul mezzo agar LB contenente l'antibiotico appropriato. Incubare a 37 gradi Celsius per otto ore. Successivamente, inoculare il mezzo LB contenente l'antibiotico appropriato con ogni singola colonia dalla piastra.
Incubare i campioni in uno shaker a 37 gradi Celsius mentre si trema a 250 giri/min. Misurare l'OD600 e la fluorescenza e calcolare l'intensità della fluorescenza se si utilizza GFP RC. Misurare lo sviluppo del colore delle colture cellulari se viene utilizzato PPG RC.
Per verificare le produttività degli amminoacidi dei ceppi candidati, preparare la coltura del seme inoculando cinque millilitri di mezzo LB con ciascuno dei ceppi candidati e lasciare che le cellule crescano durante la notte in uno shaker a 250 giri/min e a 37 gradi Celsius. Il giorno dopo, raccogliere le cellule da un millilitro della coltura cellulare centrifugando a 4000 volte G per due minuti. Scartare il supernatante e rimescolare la tavolozza con un millilitro di acqua sterile.
Inoculare 20 millilitri di mezzo M9 contenenti il quattro per cento di glucosio con 200 microlitri della sospensione cellulare e incubare in uno shaker da 250 millilitri a 250 giri/min e a 37 gradi Celsius per 24 ore. Il giorno dopo, centrifuga un millilitro del mezzo di coltura a 4000 volte G per cinque minuti. Trasferire 200 microlitri del supernatante in un tubo pulito da 1,5 millilitri.
Preparare soluzioni standard L-leucine alle concentrazioni qui indicate. In una cappa aspirante aggiungere 100 microlitri di una trietilammina millimolare e 100 microlitri di un isotiocianato di fenile molare sia al supernatante che agli standard. Mescolare delicatamente le soluzioni e incubarle a temperatura ambiente per un'ora.
Quindi, aggiungere 400 microlitri di n-esano allo stesso tubo e vortice per dieci secondi. La fase inferiore contiene i derivati amminoacidi ed è utilizzata per l'analisi HPLC. Filtrare la fase inferiore attraverso membrane in politetrafluoroetilene a 0,2 microliter.
Successivamente, eseguire un microlitri del campione su un ultra HPLC dotato di una colonna C18 con una portata di 0,42 millilitri al minuto e alla temperatura della colonna per 40 gradi Celsius. Utilizzare un rivelatore array di diodi per rilevare gli amminoacidi mirati a 254 nanometri e calcolarne le concentrazioni mappando le aree di picco sotto la curva standard. In questo studio, i sovraproduttori di amminoacidi sono identificati utilizzando rari marcatori ricchi di codoni per ottenere contemporaneamente precisione, sensibilità e alta produttività.
Per il sistema di selezione, si dovrebbe osservare una forte diminuzione dell'OD600 per i ceppi che ospitano il raro gene di resistenza agli antibiotici ricco di codoni rispetto al ceppo che ospita il tipo selvatico. L'inibizione del codone raro sulle espressioni proteiche avviene principalmente in condizioni di fame. Dopo l'alimentazione extra dell'amminoacido corrispondente, l'OD600 per il ceppo che ospita il raro gene di resistenza agli antibiotici ricco di codoni aumenta significativamente.
Per il sistema di screening, l'intensità della fluorescenza nel numero di cellule fluorescenti è significativamente inferiore per il ceppo che esprime la proteina fluorescente dal raro gene ricco di codoni rispetto al gene di tipo selvatico. L'alimentazione dell'amminoacido corrispondente ripristinerà le espressioni proteiche dai rari geni ricchi di codoni. Quando si utilizza la proteina viola, il colore sviluppato dal raro PPG ricco di codoni è più leggero di quello del gene di tipo selvatico.
Il mezzo LB non diluito consente una lenta espressione del raro PPG ricco di codoni senza che l'alimentazione dell'L-leucina nella proteina viola espressa diventi visibile una volta che le cellule sono state pellettate. Tuttavia, questo non nasconde il fatto che l'espressione genica dal raro PPG ricco di codoni è migliorata dall'alimentazione della L-leucina. La rara strategia basata sul codone potrebbe identificare i sovraproduttori degli amminoacidi mirati dalla libreria di mutazioni e questi mutanti dovrebbero produrre quantità più elevate degli amminoacidi mirati rispetto ai ceppi genitori.
Quando si tenta questa procedura, è importante regolare la rara frequenza del codone per ottenere una chiara discriminazione nell'OD o nel colore tra le cellule che ospitano i marcatori di tipo selvaggio e le rare derivate ricche di codone. L'analisi del trascritoma e il sequenziamento del genoma potrebbero essere applicati ai ceppi selezionati per indagare il meccanismo relativo alle produzioni di amminoacidi. Utilizzando questa tecnica, i sovraproduttori di amminoacidi potrebbero essere identificati in modo efficiente e l'analisi delle loro informazioni genetiche offrirebbe nuove informazioni sui loro meccanismi alla base delle sovrapproduzioni di amminoacidi.
La derivazione degli amminoacidi potrebbe essere dannosa. Assicurarsi di indossare guanti e indumenti protettivi ed eseguire questi passaggi in un cappuccio per fumi.
