이 방법은 아미노산 과잉 생산자를 얻기에 기존의 아날로그 기반 접근 방식에 효율적인 대안을 제공합니다. 이 기술은 정확도, 감도 및 높은 처리량을 동시에 제공함으로써 기존의 아날로그 기반 방법을 능가합니다. 이 방법은 아미노산 과잉 생산 강도와 희귀 코돈의 번역을 이해하는 새로운 빛을 발산하고, 이론적으로, 모든 미생물에 적용 할 수 있습니다.
이 프로토콜은 주로 따르기 쉬운 기본 분자 실험 작업에 의존하지만 긴장 문자열의 적절한 선택을 달성하기 위해 여러 시험을 요구할 수 있습니다. 이 기술의 시각적 데모는 아미노산 생산자를 식별하는 선택 및 선별 시스템의 성능에 대한 직접적인 감사를 제공합니다. 이 절차를 시작하려면, 마커 조각에 벡터를 추가, 얼음에, 1 ~ 7 점 조립 믹스의 어셈블리 믹스의 어셈블리 의 어퍼 비에 10 마이크로 리터의 총 부피에.
1 시간 동안 섭씨 50도에서 배양하십시오. 조립 제품의 5마이크로리터를 섭씨 42도에서 50마이크로리터로 30초 동안 변환합니다. 1 시간 동안 섭씨 37도에서 카타볼라이트 억압 배지로 슈퍼 최적 국물에 있는 세포를 복구하십시오.
그런 다음 LB Agar 매체에 접시를 만들고 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 배양하십시오. 다음 날, 플라스미드를 분리하기 위해 선호하는 상업용 키트를 사용합니다. 첫째, 야생형 KanR을 운반하는 플라스미드의 마이크로리터 1개로 유능한 세포의 50마이크로리터를 변환합니다.
희귀 코돈 CTA로 대체된 모든 류신 코돈으로 KanR RC 29를 함유하는 플라스미드로 유능한 세포의 두 번째 세트를 변환합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 세포 배양을 플레이트 및 배양한다. 다음으로, 희귀 코돈이 풍부한 유도체에서 야생형 선택 마커 유전자를 개별적으로 5배 희석LB 배지의 5밀리리터로 밀리리터당 50마이크로그램의 농도로 이송한다.
250 rpm에서 흔들면서 섭씨 37도에서 셰이커에 샘플을 배양합니다. 이어서, 정의된 시점에서 삼중판으로 각 세포 배양의 200마이크로리터를 96웰 플레이트로 이송한다. 플레이트 판독기를 사용하여 OD600을 측정합니다.
칸르신을 함유하고 있는 0.2 x LB 배지의 5밀리리터 2세트에서 KanR RC 29 마커 유전자를 수용하는 얼룩을 L-류신의 공급 유무에 관계없이 접종한다. 리터당 1그램의 최종 농도에 L-류신을 매체 중 하나에 추가합니다. 250 rpm에서 흔들림과 37섭씨37도에서 셰이커에 샘플을 배양하고 정의 된 시점의 각 문화에 대한 OD600을 측정합니다.
시작하려면, 야생 형 GFP 또는 야생 형 PPG를 운반하는 플라스미드의 하나의 마이크로 리터로 돌연변이 발생에 사용되는 부모 균주의 50 마이크로 리터를 변환합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 세포 배양을 플레이트 및 배양한다. 다음으로, 제대로 희석된 LB 배지의 5밀리리터로 개별적으로 콜로니를 옮기.
250 rpm에서 흔들어와 섭씨 37도에서 셰이커에 샘플을 배양. 형광 마커의 경우, 정의된 시점의 트리플리케이트에서 세포 배양200 마이크로리터를 96개의 잘 맑은 바닥 백 플레이트로 옮기는다. 형광에서 OD600을 측정하고 형광 강도를 계산합니다.
염색체 마커의 경우 세포 배양의 색상 개발을 측정합니다. 이전에 설명한 바와 같이 수유 분석서를 수행하고 정의된 시점의 형광 강도 또는 색상 개발을 측정합니다. 먼저, 선택 마커 KanR RC(29)를 운반하는 플라스미드의 1마이크로리터로 돌연변이 세포의 50마이크로리터를 변환하거나, 또는 선별 마커 GFP RC 또는 PPG RC를 변환한다. 다음으로, 세포 배양을 5분 동안 4000배 G로 원심분리합니다.
선택을 위해, 상체를 버리고 선택 마커를 운반하는 세포에 카나마이신을 함유하는 0.2 x LB 배지의 5 밀리리터를 추가한다. 섭씨 37도에서 셰이커로 밤새 샘플을 배양합니다. 다음 날, 하룻밤 문화를 카나마이신을 함유한 0.2 x LB 천 배지에 접시를 달고 12시간 동안 섭씨 37도에서 배양합니다.
스크리닝을 위해, 적절한 항생제를 함유하는 LB 천 배지에 스크리닝 마커를 수용하는 적절한 수의 세포를 플레이트한다. 8시간 동안 섭씨 37도에서 배양하세요. 그 후, 플레이트로부터 각 단일 콜로니와 적절한 항생제를 함유하는 LB 배지를 접종한다.
250 rpm에서 흔들면서 섭씨 37도에서 셰이커에 샘플을 배양합니다. GFP RC를 사용하는 경우 OD600 및 형광을 측정하고 형광 강도를 계산합니다. PPG RC를 사용하는 경우 세포 배양의 색상 개발을 측정합니다.
후보균의 아미노산 생성성을 확인하기 위해, 각 응시자 균주와 LB 배지의 5밀리리터를 접종하여 종자 배양을 준비하고 세포가 250 rpm및 섭씨 37도에서 셰이커에서 하룻밤 사이에 성장할 수 있도록 합니다. 다음 날, 세포 배양의 1 밀리리터에서 2 분 동안 4000 회 G에서 원심분리하여 세포를 수확하십시오. 상체를 버리고 1 밀리리터의 멸균물로 팔레트를 다시 분리합니다.
20 밀리리터의 M9 배지는 세포 현탁액의 200 마이크로리터를 함유하고 250 rpm에서 250 밀리리터 셰이커와 섭씨 37도에서 24시간 동안 배양합니다. 다음 날, 원심분리기 는 5 분 동안 4000 배 G에서 배양 배지의 1 밀리리터. 200 마이크로리터의 초미세먼지를 깨끗한 1.5 밀리리터 튜브로 옮킨다.
여기에 표시된 농도로 L-류신 표준 솔루션을 준비하십시오. 연기 후드에, 1 밀리머 트리에틸라민의 100 마이크로 리터와 1개의 어금니 페닐 이소티오카네이트의 마이크로리터를 슈퍼나틸트와 표준 모두에 추가합니다. 용액을 부드럽게 섞고 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
그런 다음 동일한 튜브에 400 마이크로리터를 추가하고 10 초 동안 소용돌이를 피하십시오. 하부 상에는 아미노산 유도체가 포함되어 있으며 HPLC 분석에 사용됩니다. 0.2 마이크로리터 폴리테트라플루오로로틸렌 멤브레인을 통해 하부 위상을 필터링합니다.
그런 다음 분당 0.42 밀리리터의 유속과 40°C의 열 온도가 있는 C18 컬럼을 장착한 초HPLC에서 샘플의 마이크로리터 1개를 실행합니다. 다이오드 어레이 검출기를 사용하여 254 나노미터에서 표적 아미노산을 감지하고 표준 곡선 아래의 피크 영역을 매핑하여 농도를 계산합니다. 이 연구에서 아미노산 과잉 생산자는 희귀 코돈이 풍부한 마커를 사용하여 정확도, 감도 및 높은 처리량을 동시에 달성함으로써 식별됩니다.
선발 시스템의 경우, 희귀 코돈이 풍부한 항생저항 유전자를 수용하는 균주에 대한 OD600의 급격한 감소는 야생형을 수용하는 균주에 비해 관찰되어야 한다. 단백질 발현에 희귀 코돈의 억제는 주로 굶주리고 있는 조건 하에서 일어난다. 해당 아미노산의 추가 공급 후, 희귀 코돈이 풍부한 항생제 내성 유전자를 수용하는 균주에 대한 OD600이 크게 증가한다.
스크리닝 시스템의 경우, 형광 세포의 수에 있는 형광 강도는 야생형 유전자보다 희귀 코돈이 풍부한 유전자로부터 형광 단백질을 표현하는 균주에 대해 현저히 낮다. 해당 아미노산의 공급은 희귀 코돈이 풍부한 유전자에서 단백질 발현을 회복시킬 것이다. 보라색 단백질을 사용하는 경우, 희귀 코돈이 풍부한 PPG로부터 개발된 색상은 야생형 유전자보다 가볍다.
희석되지 않은 LB 배지는 세포가 펠릿화되면 발현된 보라색 단백질에서 L-류신 공급없이 희귀 코돈이 풍부한 PPG의 느린 발현을 허용한다. 그러나, 이것은 희소한 코돈 이 풍부한 PPG에서 유전자 발현이 L-류신의 공급에 의해 강화된다는 사실을 은폐하지 않습니다. 희귀 코돈 기반 전략은 돌연변이 라이브러리에서 표적 아미노산의 과잉 생산자를 식별 할 수 있으며,이 돌연변이는 부모 균주보다 표적 아미노산의 높은 금액을 생산해야합니다.
이 절차를 시도할 때, 희귀 코돈 주파수를 조정하여 야생형 마커와 희귀 코돈이 풍부한 유도체를 수용하는 세포 간의 OD 또는 색상에서 명확한 차별을 달성하는 것이 중요합니다. 전사 분석 및 게놈 시퀀싱은 아미노산 생산과 관련된 메커니즘을 조사하기 위해 선택된 균주에 적용될 수 있다. 이 기술을 사용하여 아미노산 과잉 생산자는 효율적으로 식별 될 수 있으며 유전 정보의 분석은 아미노산 과잉 생산 뒤에 자신의 메커니즘에 대한 새로운 통찰력을 제공 할 것입니다.
아미노산 유도는 유해할 수 있습니다. 장갑과 보호복을 착용하고 연기 후드로 이러한 단계를 수행해야 합니다.
