Cette méthode offre une alternative efficace à l’approche analogique conventionnelle dans l’obtention de surproducteurs d’acides aminés. Cette technique surcompétent la méthode analogique traditionnelle en fournissant la précision, la sensibilité et le débit élevé simultanément. Cette méthode jette un nouvel éclairage sur la compréhension des forces de surproduction d’acides aminés et la traduction de codons rares et pourrait, théoriquement, être appliquée à tous les micro-organismes.
Ce protocole repose principalement sur des opérations expérimentales moléculaires de base faciles à suivre, mais qui peuvent nécessiter de multiples essais afin d’obtenir la sélection appropriée des cordes de contrainte. Une démonstration visuelle de cette technique offre une appréciation directe de la performance de la sélection et un système de dépistage dans l’identification des producteurs d’acides aminés. Pour commencer cette procédure, ajouter le vecteur dans les fragments marqueurs, sur la glace, dans un rapport molaire de un à un à sept points cinq microlitres de mélange d’assemblage à un volume total de dix microlitres.
Incuber à 50 degrés Celsius pendant une heure. Transformez cinq microlitres du produit d’assemblage en 50 microlitres de cellules composants à 42 degrés Celsius pendant 30 secondes. Récupérer les cellules dans le bouillon Super Optimal avec catabolite moyen de répression à 37 degrés Celsius pendant une heure.
Ensuite, plaquez-les sur LB Agar moyen et couvez pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Le lendemain, utilisez un kit commercial préféré pour isoler le plasmide. Tout d’abord, transformer 50 microlitres des cellules compétentes avec un microlitre de plasmide qui porte le kanr de type sauvage.
Transformez un deuxième ensemble des cellules compétentes avec le plasmide contenant KanR RC 29 avec tous les codons de leucine remplacés par le CTA codon rare. Plaquez et incubez la culture cellulaire tel qu’il est décrit dans le protocole textuel. Ensuite, transférez les colonies qui abritent le gène marqueur de sélection de type sauvage dans le dérivé rare riche en codon individuellement en cinq millilitres de milieu LB dilué quintuple contenant de la kanamycine à une concentration de 50 microgrammes par millilitre.
Incuber les échantillons dans un shaker à 37 degrés Celsius tout en secouant à 250 rpm. Ensuite, transférez 200 microlitres de chacune des cultures cellulaires dans une plaque de puits de 96 en triplicate à des points de temps définis. Utilisez un lecteur de plaque pour mesurer l’OD600.
Inoculer les taches abritant le gène marqueur KanR RC 29 en deux ensembles de cinq millilitres du milieu de 0,2 x LB qui contient de la kanamycine, avec ou sans approvisionnement en L-leucine. Ajouter la L-leucine à l’un des supports à une concentration finale d’un gramme par litre. Incuber les échantillons dans un shaker à 37 degrés Celsius avec des secousses à 250 rpm et mesurer l’OD600 pour chaque culture à des moments définis.
Pour commencer, transformez 50 microlitres de la souche mère utilisée pour la mutagenèse avec un microlitre de plasmide qui transporte le GFP de type sauvage ou le PPG de type sauvage. Plaquez et incubez les cultures cellulaires telles qu’décrites dans le protocole textuel. Ensuite, transférez les colonies individuellement à cinq millilitres du milieu LB correctement dilué.
Incuber les échantillons dans un shaker à 37 degrés Celsius avec des secousses à 250 rpm. Pour les marqueurs de fluorescence, transférer 200 microlitres des cultures cellulaires dans une plaque arrière inférieure bien claire de 96 dans le triplicate à des points de temps définis. Mesurez l’OD600 dans la fluorescence et calculez l’intensité de fluorescence.
Pour les marqueurs chromogènes, mesurer le développement des couleurs des cultures cellulaires. Effectuez l’analyse d’alimentation comme décrit précédemment et mesurez l’intensité de fluorescence ou le développement des couleurs à des points de temps définis. Tout d’abord, transformer 50 microlitres des cellules mutantes avec un microlitre du plasmide portant le marqueur de sélection KanR RC 29, ou les marqueurs de criblage GFP RC ou PPG RC. Ensuite, centrifuger les cultures cellulaires à 4000 fois G pendant cinq minutes.
Pour la sélection, jetez le supernatant et ajoutez cinq millilitres de 0,2 x LB moyen contenant de la kanamycine aux cellules portant le marqueur de sélection. Incuber l’échantillon toute la nuit dans un shaker à 37 degrés Celsius. Le lendemain, plaquez la culture de nuit sur le milieu d’agar de 0,2 x LB contenant de la kanamycine et incubez à 37 degrés Celsius pendant 12 heures.
Pour le dépistage, plaquez le nombre approprié de cellules abritant le marqueur de criblage sur le milieu de l’agar LB contenant l’antibiotique approprié. Incuber à 37 degrés Celsius pendant huit heures. Après cela, inoculer le milieu LB contenant l’antibiotique approprié avec chaque colonie unique de la plaque.
Incuber les échantillons dans un shaker à 37 degrés Celsius tout en secouant à 250 rpm. Mesurez l’OD600 et la fluorescence et calculez l’intensité de fluorescence si gfp RC est utilisé. Mesurer le développement des couleurs des cultures cellulaires si PPG RC est utilisé.
Pour vérifier les produits aux acides aminés des souches candidats, préparez la culture des graines en inoculant cinq millilitres de lb moyen avec chacune des souches candidats et laissez les cellules se développer pendant la nuit dans un shaker à 250 rpm et à 37 degrés Celsius. Le lendemain, récoltez les cellules à partir d’un millilitre de la culture cellulaire en centrifugant à 4000 fois G pendant deux minutes. Jetez le supernatant et resuspendez la palette avec un millilitre d’eau stérile.
Inoculer 20 millilitres de M9 moyen contenant quatre pour cent de glucose avec 200 microlitres de la suspension cellulaire et incuber dans un shaker de 250 millilitres à 250 tours et à 37 degrés Celsius pendant 24 heures. Le lendemain, centrifugeuse d’un millilitre du milieu culturel à 4000 fois G pendant cinq minutes. Transférer 200 microlitres du supernatant dans un tube propre de 1,5 millilitre.
Préparez des solutions standard L-leucine aux concentrations indiquées ici. Dans une hotte de fumée, ajouter 100 microlitres d’une triethylamine millimolaire et 100 microlitres d’un isothiocyanate de phényl molaire au supernatant et aux normes. Mélanger les solutions en douceur et les incuber à température ambiante pendant une heure.
Ensuite, ajoutez 400 microlitres de n-hexane au même tube et vortex pendant dix secondes. La phase inférieure contient les dérivés d’acides aminés et est utilisée pour l’analyse HPLC. Filtrer la phase inférieure à travers les membranes de polytétrafluoroéthylène de 0,2 microlitre.
Après cela, exécutez un microlitre de l’échantillon sur un ultra HPLC équipé d’une colonne C18 avec un débit de 0,42 millilitres par minute et à la température de la colonne pour 40 degrés Celsius. Utilisez un détecteur de réseau de diodes pour détecter les acides aminés ciblés à 254 nanomètres et calculer leurs concentrations en cartographiant les zones de pointe sous la courbe standard. Dans cette étude, les surproducteurs d’acides aminés sont identifiés en utilisant des marqueurs rares riches en codon pour atteindre simultanément la précision, la sensibilité et le haut débit.
Pour le système de sélection, une forte diminution de l’OD600 pour les souches abritant le gène rare de résistance aux antibiotiques riche en codon doit être observée par rapport à la souche abritant le type sauvage. L’inhibition du codon rare sur les expressions protéiques se fait principalement dans des conditions de faim. Après l’alimentation supplémentaire de l’acide aminé correspondant, l’OD600 pour la souche abritant le gène rare de résistance aux antibiotiques codon-riche augmente de manière significative.
Pour le système de criblage, l’intensité de fluorescence dans le nombre de cellules fluorescentes est sensiblement inférieure pour la souche qui exprime la protéine fluorescente du gène codon-riche rare que du gène sauvage-type. L’alimentation de l’acide aminé correspondant restaurera les expressions protéiques des rares gènes riches en codon. Lors de l’utilisation de la protéine pourpre, la couleur développée à partir du PPG rare riche en codon est plus léger que celui du gène de type sauvage.
Le milieu LB non dilué permet l’expression lente du PPG rare codon-riche sans alimentation de L-leucine dans la protéine pourpre exprimée devient visible une fois que les cellules sont granulées. Cependant, ceci ne cache pas le fait que l’expression de gène du PPG codon-riche rare est augmentée par l’alimentation de la L-leucine. La stratégie rare basée sur le codon pourrait identifier les surproducteurs des acides aminés ciblés de la bibliothèque de mutation et ces mutants devraient produire des quantités plus élevées des acides aminés ciblés que les souches parentes.
Lors de la tentative de cette procédure, il est important d’ajuster la fréquence rare codon pour atteindre une discrimination claire dans l’OD ou la couleur entre les cellules hébergeant les marqueurs de type sauvage et les dérivés rares codon riche. L’analyse transcriptome et le séquençage du génome pourraient être appliqués aux souches sélectionnées pour étudier le mécanisme lié aux productions d’acides aminés. En utilisant cette technique, les surproducteurs d’acides aminés pourraient être identifiés efficacement et l’analyse de leurs informations génétiques offrirait de nouvelles perspectives sur leurs mécanismes derrière les surproductions d’acides aminés.
La dérivation des acides aminés pourrait être nocive. Assurez-vous de porter des gants et des vêtements de protection et d’effectuer ces étapes dans une hotte de fumée.
