توفر هذه الطريقة بديلاً فعالاً للنهج التقليدي القائم على التناظرية في الحصول على الأحماض الأمينية المفرطة. هذه التقنية outcompetes الأسلوب التقليدي المستندة إلى التناظرية بتوفير دقة حساسية و سرعة عالية في نفس الوقت. هذه الطريقة يلقي ضوءا جديدا على فهم الأحماض الأمينية الإفراط في إنتاج القوة وترجمة كودونات نادرة، ويمكن، نظريا، يمكن تطبيقها على جميع الكائنات الحية الدقيقة.
يعتمد هذا البروتوكول في الغالب على العمليات التجريبية الجزيئية الأساسية التي يسهل اتباعها ولكنها قد تتطلب تجارب متعددة من أجل تحقيق الاختيار المناسب من السلاسل المجهدة. عرض مرئي لهذه التقنية يقدم تقديراً مباشراً على أداء الاختيار ونظام فحص في تحديد منتجي الأحماض الأمينية. لبدء هذا الإجراء، إضافة المتجه في شظايا علامة، على الجليد، في نسبة المول من واحد إلى سبع نقاط خمس ميكرولترات من مزيج التجميع إلى حجم إجمالي قدره عشرة ميكرولترات.
احتضان في 50 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. تحويل خمسة ميكرولترات من المنتج التجميع إلى 50 ميكرولترات من الخلايا المكونة في 42 درجة مئوية لمدة 30 ثانية. استعادة الخلايا في مرق سوبر الأمثل مع قمع Catabolite المتوسطة في 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.
ثم، لوحة لهم على LB أغار المتوسطة واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. في اليوم التالي، استخدم مجموعة مفضلة تجارية لعزل البلازميد. أولا ، تحويل 50 ميكرولترات من الخلايا المختصة مع ميكرولتر واحد من plasmid التي تحمل كانر من النوع البرية.
تحويل مجموعة ثانية من الخلايا المختصة مع plasmid التي تحتوي على KanR RC 29 مع جميع codons leucine استبدالها كودون CTA نادرة. لوحة واحتضان ثقافة الخلية كما هو موضح في بروتوكول النص. بعد ذلك ، نقل المستعمرات التي تؤوي جين علامة الاختيار من النوع البري في المشتقة الغنية بالكدون النادرة بشكل فردي إلى خمسة ملليلتر من متوسط LB المخفف خمسة أضعاف يحتوي على الكاناميسين بتركيز 50 ميكروغرام لكل ملليلتر.
احتضان العينات في شاكر في 37 درجة مئوية في حين تهتز في 250 دورة في الدقيقة. ثم، نقل 200 ميكرولتراتر من كل من الثقافات الخلية إلى لوحة 96 جيدا في ثلاث ية في نقاط زمنية محددة. استخدام قارئ لوحة لقياس OD600.
تلقيح البقع التي تؤوي الجين علامة KanR RC 29 في مجموعتين من خمس ملليلتر من 0.2 × LB المتوسطة التي تحتوي على kanamycin، مع أو بدون إمدادات من L-leucine. إضافة L-leucine إلى واحدة من وسائل الإعلام إلى تركيز النهائي من غرام واحد للتر الواحد. احتضان العينات في شاكر في 37 درجة مئوية مع اهتزاز في 250 دورة في الدقيقة وقياس OD600 لكل ثقافة في نقاط زمنية محددة.
للبدء ، وتحويل 50 ميكرولترات من سلالة الأم المستخدمة في الطفرات مع ميكرولتر واحد من plasmid التي تحمل GFP من النوع البرية أو PPG من النوع البرية. لوحة واحتضان ثقافات الخلية كما هو موضح في بروتوكول النص. بعد ذلك، نقل المستعمرات بشكل فردي إلى خمسة ملليلتر من متوسط LB المخفف بشكل صحيح.
احتضان العينات في شاكر في 37 درجة مئوية مع اهتزاز في 250 دورة في الدقيقة. بالنسبة لعلامات الفلوريس، نقل 200 ميكرولترات من ثقافات الخلايا إلى 96 لوحة خلفية واضحة بشكل جيد في ثلاث نسخ في نقاط زمنية محددة. قياس OD600 في الفلوريسنس وحساب كثافة الفلوريسين.
بالنسبة لعلامات chromogenic، قياس تطور اللون من الثقافات الخلية. تنفيذ فحص التغذية كما هو موضح سابقا وقياس كثافة الفلوريسين أو تطور اللون في نقاط زمنية محددة. أولا، تحويل 50 ميكرولتردات من الخلايا المتحولة مع ميكرولتر واحد من البلازميد تحمل علامة اختيار KanR RC 29، أو علامات الفرز GFP RC أو PPG RC. بعد ذلك، أجهزة الطرد المركزي الثقافات الخلية في 4000 مرات G لمدة خمس دقائق.
لاختيار، والتخلص من عظمى وإضافة خمسة ملليلترات من 0.2 × LB المتوسطة التي تحتوي على kanamycin إلى الخلايا التي تحمل علامة الاختيار. احتضان العينة بين عشية وضحاها في شاكر في 37 درجة مئوية. في اليوم التالي، لوحة ثقافة بين عشية وضحاها على 0.2 × LB أغار المتوسطة التي تحتوي على كاناميسين واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 12 ساعة.
للفحص، لوحة العدد المناسب من الخلايا التي تأوي علامة الفحص على LB agar المتوسطة التي تحتوي على المضادات الحيوية المناسبة. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة ثماني ساعات. بعد ذلك، تلقيح متوسطة LB التي تحتوي على المضاد الحيوي المناسب مع كل مستعمرة واحدة من الصفيحة.
احتضان العينات في شاكر في 37 درجة مئوية في حين تهتز في 250 دورة في الدقيقة. قياس OD600 وفلوريسنس وحساب كثافة الفلورس إذا تم استخدام GFP RC. قياس تطور الألوان من الثقافات الخلية إذا تم استخدام PPG RC.
للتحقق من إنتاجية الأحماض الأمينية من سلالات المرشح، وإعداد ثقافة البذور عن طريق تلقيح خمسة ملليلتر من LB المتوسطة مع كل من سلالات المرشح والسماح للخلايا تنمو بين عشية وضحاها في شاكر في 250 دورة في الدقيقة وعند 37 درجة مئوية. في اليوم التالي، حصاد الخلايا من ملليلتر واحد من خلية من ثقافة عن طريق الطرد المركزي في 4000 مرات G لمدة دقيقتين. تجاهل السوبر و resuspend لوحة مع ملليلتر واحد من الماء المعقم.
تلقيح 20 ملليلتر من M9 المتوسطة التي تحتوي على أربعة في المئة الجلوكوز مع 200 ميكرولترات من تعليق الخلية واحتضان في شاكر 250 ملليلتر في 250 دورة في الدقيقة وعند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. وفي اليوم التالي، كان جهاز الطرد المركزي ملليلتراً واحداً من الوسط الثقافي عند 4000 مرة من G لمدة خمس دقائق. نقل 200 ميكرولترات من عظمى إلى أنبوب 1.5 ملليلتر نظيفة.
إعداد حلول L-leucine القياسية في التركيزات هو مبين هنا. في غطاء الدخان، إضافة 100 ميكرولترات من ثلاثي اليثيلامين واحد ملليمولار و 100 ميكرولترات من واحد المولر فينيل isothiocyanate إلى كل من فائقة والمعايير. اخلطي الحلول بلطف وحضنيها في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة.
ثم، إضافة 400 ميكرولترات من ن-الهيكسان إلى نفس الأنبوب ودوامة لمدة عشر ثوان. المرحلة السفلي يحتوي على مشتقات الأحماض الأمينية ويستخدم لتحليل HPLC. تصفية المرحلة السفلى من خلال 0.2 أغشية البوليتيترافلورو الإيثيلين ميكرولتر.
بعد ذلك، قم بتشغيل ميكرولتر واحد من العينة على HPLC فائقة مجهزة بعمود C18 بمعدل تدفق 0.42 ملليلتر في الدقيقة وفي درجة حرارة العمود ل 40 درجة مئوية. استخدم كاشف صفيف ثنائي ثنائي للكشف عن الأحماض الأمينية المستهدفة في 254 نانومتر وحساب تركيزاتها عن طريق رسم خرائط مناطق الذروة تحت المنحنى القياسي. في هذه الدراسة، يتم تحديد الإفراط في إنتاج الأحماض الأمينية باستخدام علامات نادرة الغنية بالكدون لتحقيق الدقة والحساسية والإنتاجية العالية في وقت واحد.
بالنسبة لنظام الاختيار ، يجب ملاحظة انخفاض حاد في OD600 للسلالات التي تؤوي جين مقاومة المضادات الحيوية الغنية بالكدون النادرة بالمقارنة مع السلالة التي تؤوي النوع البري. تثبيط كودون نادرة على تعبيرات البروتين يحدث في الغالب في ظل ظروف تجويع. بعد التغذية الإضافية من الأحماض الأمينية المقابلة، وOD600 لسلالة إيواء الجينات النادرة الغنية بالمضادات الحيوية codon الغنية يزيد بشكل ملحوظ.
بالنسبة لنظام الفحص ، فإن شدة الفلوريس في عدد الخلايا الفلورية أقل بكثير بالنسبة للإجهاد الذي يعبر عن البروتين الفلوري من الجين النادر الغني بالكدون منه من الجين البري. تغذية من الأحماض الأمينية المقابلة سوف استعادة التعبيرات البروتين من الجينات النادرة الغنية كودون. عند استخدام البروتين الأرجواني ، فإن اللون الذي تم تطويره من PPG الغنية بالكودون النادرة أخف من ذلك من الجين البري.
يسمح متوسط LB غير المخفف بالتعبير البطيء عن PPG الغنية بالكدون النادرة دون تغذية L-leucine في البروتين الأرجواني المعبر عنه يصبح مرئيًا بمجرد أن يتم بيليه الخلايا. ومع ذلك، هذا لا يخفي حقيقة أن يتم تعزيز التعبير الجيني من PPG الغنية كودون نادرة عن طريق تغذية ل-لوسين. استراتيجية نادرة القائمة على كودون يمكن تحديد الإفراط في إنتاج الأحماض الأمينية المستهدفة من مكتبة الطفرات وهذه المسوخ ينبغي أن تنتج كميات أعلى من الأحماض الأمينية المستهدفة من سلالات الأم.
عند محاولة هذا الإجراء، من المهم ضبط تردد كودون نادرة لتحقيق تمييز واضح في OD أو اللون بين الخلايا التي تأوي علامات من النوع البري ومشتقاتها الغنية بالكدون النادرة. ويمكن تطبيق تحليل النسخ وتسلسل الجينوم على السلالات المختارة للتحقيق في الآلية المتعلقة بإنتاج الأحماض الأمينية. باستخدام هذه التقنية، يمكن تحديد الإفراط في إنتاج الأحماض الأمينية بكفاءة وتحليل معلوماتهم الوراثية من شأنه أن يقدم رؤى جديدة في آلياتها وراء الإفراط في إنتاج الأحماض الأمينية.
يمكن أن يكون اشتقاق الأحماض الأمينية ضارة. تأكد من ارتداء القفازات والملابس الواقية وأداء هذه الخطوات في غطاء أبخرة.
