この方法は、アミノ酸オーバープロデューサを得る際の従来のアナログベースアプローチに代わる効率的な代替手段を提供する。この手法は、精度、感度、高スループットを同時に提供することで、従来のアナログベースの手法と競合します。この方法は、アミノ酸の過剰生産強度の理解と希少なコドンの翻訳に新たな光を当て、理論的には、すべての微生物に適用することができます。
このプロトコルは、主に従いやすいが、緊張糸の適切な選択を達成するために複数の試験を必要とする可能性がある基本的な分子実験操作に依存しています。この技術の視覚的なデモンストレーションは、選択のパフォーマンスとアミノ酸生産者を同定するスクリーニングシステムに直接感謝を提供する。この手順を開始するには、マーカーフラグメントの1〜1〜7ポイントのモル比で1〜1〜7ポイントのアセンブリミックスの5マイクロリットルを総体積10マイクロリットルに加えます。
摂氏50度で1時間インキュベートします。アセンブリ製品の5マイクロリットルを摂氏42度で50マイクロリットルの構成部品セルに30秒間変換します。1時間の間、37°Cでカタボライト抑圧媒体で超最適なスープの細胞を回復します。
その後、LB寒天培地にプレートし、摂氏37度で一晩インキュベートします。翌日、好ましい市販キットを使用してプラスミドを分離する。まず、野生型KanRを運ぶプラスミドの1マイクロリットルで有能な細胞の50マイクロリットルを変換します。
希少なコドンCTAに置換されたすべてのロイシンコドンを用いて、KanR RC 29を含むプラスミドを有するコンピテントセルの第2セットを変換する。プレートと、テキストプロトコルで概説されているように細胞培養をインキュベートする。次に、希少コドンが豊富な誘導体に野生型選択マーカー遺伝子を収容するコロニーを、1ミリリットル当たり50マイクログラムの濃度でカナマイシンを含む5倍希釈LB培地の5ミリリットルに個別に移す。
250 rpmで振りながら、37°Cのシェーカーでサンプルをインキュベートします。次に、各細胞培養物の200マイクロリットルを、定義された時点で3重に96ウェルプレートに移す。プレートリーダーを使用してOD600を測定します。
カナマイシンを含む0.2 x LB培地の5ミリリットルの2組にKanR RC29マーカー遺伝子を含む染色を、L-ロイシンの供給の有無にかかわらず接種する。L-ロイシンを1リットル当たり1グラムの最終濃度に培地の1つに加えます。250 rpmで揺れ、37°Cのシェーカーでサンプルをインキュベートし、定義された時点で各培養物のOD600を測定します。
まず、野生型GFPまたは野生型PPGを運ぶプラスミドの1マイクロリットルで突然変異誘発に使用される親株の50マイクロリットルを変換します。プレートおよびテキストプロトコルで概説されているように細胞培養物をインキュベートする。次に、適切に希釈したLB培地の5ミリリットルにコロニーを個別に移す。
250 rpmで振ると、37°Cのシェーカーでサンプルをインキュベートします。蛍光マーカーの場合、細胞培養物200マイクロリットルを、定義された時点で3重に96の明確な底裏板に移します。蛍光でOD600を測定し、蛍光強度を計算します。
発色マーカーの場合、細胞培養物の色の発達を測定する。前述のように給餌アッセイを行い、定義された時点で蛍光強度または色の発達を測定する。まず、選択マーカーKanR RC29、またはスクリーニングマーカーGFP RCまたはPPG RCを担うプラスミドの1マイクロリットルで変異細胞の50マイクロリットルを変換する。次に、5分間Gの4000倍の細胞培養物を遠心する。
選択のために、上清を捨て、カナマイシンを含む0.2 x LB培地を5ミリリットル加えて、選択マーカーを運ぶ細胞に加えます。37°Cのシェーカーで一晩サンプルをインキュベートします。翌日、カナマイシンを含む0.2 x LB寒天培地に一晩培養し、摂氏37度で12時間培養します。
スクリーニングのために、適切な数の細胞を適切な抗生物質を含むLB寒天培地上にスクリーニングマーカーを収容する。摂氏37度で8時間インキュベートします。この後、プレートから各単一コロニーに適切な抗生物質を含むLB培地を接種する。
250 rpmで振りながら、37°Cのシェーカーでサンプルをインキュベートします。OD600と蛍光を測定し、GFP RCを使用する場合は蛍光強度を計算します。PPG RCを使用する場合、細胞培養物の色の発達を測定します。
候補株のアミノ酸生産性を検証するには、候補株のそれぞれで5ミリリットルのLB培地を接種して種子培養を準備し、250rpmで摂氏37度でシェーカーで細胞を一晩成長させます。翌日、Gの4000倍で2分間遠心して細胞培養の1ミリリットルから細胞を収穫する。上清を捨て、1ミリリットルの滅菌水でパレットを再中断します。
細胞懸濁液の200マイクロリットルで4パーセントのグルコースを含むM9培地の20ミリリットルを接種し、250rpmで250ミリリットルシェーカーでインキュベートし、24時間摂氏37度でインキュベートする。翌日、培養培地の1ミリリットルをGの4000倍で5分間遠心する。200マイクロリットルの上清をきれいな1.5ミリリットルの管に移す。
ここに示す濃度でL-ロイシン標準溶液を調製する。ヒュームフードには、1ミリモルトリエチルアミン100マイクロリットルと1モルフェニルイソチオシアネート100マイクロリットルを上清と標準の両方に加えます。溶液を軽く混ぜ、室温で1時間インキュベートします。
その後、同じチューブに400マイクロリットルのn-ヘキサンを加え、それを10秒間渦に入れます。下の相はアミノ酸誘導体を含み、HPLC分析に使用されます。0.2マイクロリットルのポリテトラフルオロエチレン膜を通して低相をフィルター処理します。
この後、1マイクロリットルのサンプルを、1分あたり0.42ミリリットルの流量を有するC18カラムを装備した超HPLC上で、40°Cのカラム温度で実行します。ダイオードアレイ検出器を使用して、254ナノメートルで標的となるアミノ酸を検出し、標準曲線下のピーク領域をマッピングしてその濃度を計算します。本研究では、アミノ酸の過剰生産物を、希少なコドンを豊富に含むマーカーを使用して、精度、感度、高スループットを同時に達成することによって同定されています。
選択システムでは、希少なコドンが豊富な抗生物質耐性遺伝子を含む株のOD600の急激な減少は、野生型を収容する株と比較して観察されるべきである。タンパク質表現に対する希少コドンの阻害は、主に飢えた状態下で行われます。対応するアミノ酸の余分な供給後、希少なコドンが豊富な抗生物質耐性遺伝子を収容する株用OD600が大幅に増加する。
スクリーニングシステムの場合、蛍光細胞数の蛍光強度は、野生型遺伝子よりも希少なコドンリッチ遺伝子から蛍光タンパク質を発現する株に対して有意に低い。対応するアミノ酸の供給は、希少なコドンが豊富な遺伝子からタンパク質表現を回復する。紫色のタンパク質を使用する場合、希少なコドンが豊富なPPGから開発された色は、野生型遺伝子の色よりも軽い。
希釈されていないLB培地は、細胞がペレット化されると、発現した紫色タンパク質中でL-ロイシンの供給なしに希少なコドンリッチPPGの遅い発現を可能にする。しかし、これは希少なコドンリッチPPGからの遺伝子発現がL-ロイシンの摂食によって増強されるという事実を隠さない。まれなコドンベースの戦略は、突然変異ライブラリーから標的アミノ酸の過剰生産者を同定することができ、これらの突然変異体は親株よりも高い量の標的アミノ酸を産生すべきである。
この手順を試みる場合、野生型マーカーを含む細胞と希少コドンが豊富な誘導体を含む細胞間のODまたは色の明確な差別を達成するために、希少なコドン周波数を調整することが重要である。トランスクリプトーム解析とゲノムシーケンシングを、選択した株に適用して、アミノ酸産生に関連するメカニズムを調べることができました。この技術を用いて、アミノ酸の過剰生産者を効率的に同定することができ、その遺伝情報の分析は、アミノ酸過剰産生の背後にあるメカニズムに関する新しい洞察を提供するであろう。
アミノ酸誘導体化は有害である可能性があります。.手袋と防護服を着用し、ヒュームフードでこれらの手順を実行することを確認してください。
