Diese Methode bietet eine effiziente Alternative zum herkömmlichen analogen Ansatz bei der Gewinnung von Aminosäureüberproduzenten. Diese Technik übertrifft die herkömmliche analoge Methode, indem sie genauigkeit, Empfindlichkeit und hohen Durchsatz gleichzeitig bereitstellt. Diese Methode wirft ein neues Licht auf das Verständnis der Überproduktionsstärken von Aminosäuren und die Übersetzung seltener Kodone und könnte theoretisch auf alle Mikroorganismen angewendet werden.
Dieses Protokoll stützt sich hauptsächlich auf grundlegende molekulare experimentelle Operationen, die leicht zu befolgen sind, aber möglicherweise mehrere Versuche erfordern, um die geeignete Auswahl von belastenden Stringencies zu erreichen. Eine visuelle Demonstration dieser Technik bietet eine direkte Wertschätzung der Leistung der Auswahl und ein Screening-System bei der Identifizierung von Aminosäurenherstellern. Um dieses Verfahren zu beginnen, fügen Sie den Vektor in den Markerfragmenten, auf Eis, in einem Molverhältnis von eins zu eins zu sieben Punkt fünf Mikroliter Montagemischung zu einem Gesamtvolumen von zehn Mikrolitern.
Eine Stunde lang bei 50 Grad Celsius brüten. Verwandeln Sie fünf Mikroliter des Montageprodukts 30 Sekunden lang in 50 Mikroliter Komponentenzellen bei 42 Grad Celsius. Stellen Sie die Zellen in Super Optimal Brühe mit Katabolit Repression Medium bei 37 Grad Celsius für eine Stunde.
Dann, Platte sie auf LB Agar Medium und inkubieren über Nacht bei 37 Grad Celsius. Verwenden Sie am nächsten Tag ein bevorzugtes kommerzielles Kit, um das Plasmid zu isolieren. Erstens transformieren Sie 50 Mikroliter der kompetenten Zellen mit einem Mikroliter Plasmid, der den Wildtyp KanR trägt.
Transformieren Sie einen zweiten Satz der kompetenten Zellen mit dem Plasmid, das KanR RC 29 enthält, wobei alle Leucin-Codons durch das seltene Codon CTA ersetzt werden. Plate und inkubieren Sie die Zellkultur, wie im Textprotokoll beschrieben. Übertragen Sie als nächstes die Kolonien, die das Wildtyp-Selektionsmarkergen in dem selten-codonreichen Derivat beherbergen, einzeln in fünf Milliliter fünffach verdünntes LB-Medium mit Kanamycin in einer Konzentration von 50 Mikrogramm pro Milliliter.
Inkubieren Sie die Proben in einem Shaker bei 37 Grad Celsius, während sie bei 250 Rpm schütteln. Dann übertragen Sie 200 Mikroliter jeder der Zellkulturen in eine 96-Well-Platte in dreifacher Auslaktezustellung zu definierten Zeitpunkten. Verwenden Sie einen Plattenleser, um den OD600 zu messen.
Impfen Sie die Flecken, die das KanR RC 29 Marker-Gen beherbergen, in zwei Sätzen von fünf Millilitern des 0,2 x LB Mediums, das Kanamycin enthält, mit oder ohne Zufuhr von L-Leucin. Fügen Sie L-Leucin zu einem der Medien mit einer Endkonzentration von einem Gramm pro Liter hinzu. Inkubieren Sie die Proben in einem Shaker bei 37 Grad Celsius mit Schütteln bei 250 Rpm und messen Sie die OD600 für jede Kultur zu definierten Zeitpunkten.
Um zu beginnen, transformieren Sie 50 Mikroliter des Elternstamms, der für die Mutagenese verwendet wird, mit einem Mikroliter Plasmid, der den Wildtyp GFP oder den Wildtyp PPG trägt. Platte und inkubieren Sie die Zellkulturen, wie im Textprotokoll beschrieben. Als nächstes übertragen Sie die Kolonien einzeln auf fünf Milliliter des ordnungsgemäß verdünnten LB-Mediums.
Inkubieren Sie die Proben in einem Shaker bei 37 Grad Celsius mit Schütteln bei 250 Rpm. Übertragen Sie bei Fluoreszenzmarkern 200 Mikroliter der Zellkulturen in eine 96 gut klare Bodenrückplatte in dreifacher Auszeit zu definierten Zeitpunkten. Messen Sie die OD600 in der Fluoreszenz und berechnen Sie die Fluoreszenzintensität.
Bei chromogenen Markern können Sie die Farbentwicklung der Zellkulturen messen. Führen Sie den Fütterungstest wie zuvor beschrieben durch und messen Sie die Fluoreszenzintensität oder die Farbentwicklung zu definierten Zeitpunkten. Zunächst transformieren Sie 50 Mikroliter der mutierten Zellen mit einem Mikroliter des Plasmids, das den Selektionsmarker KanR RC 29 oder die Screening-Marker GFP RC oder PPG RC trägt. Als nächstes zentrifugieren Sie die Zellkulturen bei 4000 mal G für fünf Minuten.
Zur Auswahl den Überstand ablegen und fünf Milliliter 0,2 x LB-Medium mit Kanamycin zu Zellen hinzufügen, die den Selektionsmarker tragen. Inkubieren Sie die Probe über Nacht in einem Shaker bei 37 Grad Celsius. Am nächsten Tag die Nachtkultur auf 0,2 x LB-Agarmedium mit Kanamycin aufbringen und 12 Stunden lang bei 37 Grad Celsius brüten.
Zum Screening die entsprechende Anzahl von Zellen, die den Screening-Marker beherbergen, auf lb-Agarmedium, das das entsprechende Antibiotikum enthält. Bei 37 Grad Celsius für acht Stunden inkubieren. Danach impfen Sie das LB-Medium, das das entsprechende Antibiotikum enthält, mit jeder einzelnen Kolonie von der Platte.
Inkubieren Sie die Proben in einem Shaker bei 37 Grad Celsius, während sie bei 250 Rpm schütteln. Messen Sie die OD600 und die Fluoreszenz und berechnen Sie die Fluoreszenzintensität, wenn GFP RC verwendet wird. Messen Sie die Farbentwicklung der Zellkulturen, wenn PPG RC verwendet wird.
Um die Aminosäure-Imulitäten der Kandidatenstämme zu überprüfen, bereiten Sie die Samenkultur vor, indem Sie fünf Milliliter LB-Medium mit jedem der Kandidatenstämme impfen und die Zellen über Nacht in einem Shaker bei 250 Umdrehungen pro Minute und bei 37 Grad Celsius wachsen lassen. Am nächsten Tag ernten Sie die Zellen von einem Milliliter der Zellkultur, indem Sie bei 4000 mal G für zwei Minuten zentrieren. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie die Palette mit einem Milliliter sterilem Wasser wieder auf.
20 Milliliter M9-Medium mit vier Prozent Glukose mit 200 Mikrolitern der Zellsuspension impfen und in einem 250-Milliliter-Shaker bei 250 U/min und bei 37 Grad Celsius für 24 Stunden inkubieren. Am nächsten Tag zentrifugieren Sie einen Milliliter des Kulturmediums bei 4000 mal G für fünf Minuten. 200 Mikroliter des Überstandes in ein sauberes 1,5-Milliliter-Rohr geben.
Bereiten Sie L-Leucin Standardlösungen in den hier gezeigten Konzentrationen vor. In einer Dunstabzugshaube fügen Sie 100 Mikroliter eines Millimolaren Triethylamins und 100 Mikroliter eines Molarenphenylisothiocyanats sowohl dem Überstand als auch den Standards hinzu. Mischen Sie die Lösungen sanft und inkubieren Sie sie bei Raumtemperatur für eine Stunde.
Dann 400 Mikroliter n-Hexan in das gleiche Rohr geben und zehn Sekunden lang wirbeln. Die untere Phase enthält die Aminosäurederivate und wird für die HPLC-Analyse verwendet. Filtern Sie die untere Phase durch 0,2 Mikroliter Polytetrafluorethylenmembranen.
Danach einen Mikroliter der Probe auf einem Ultra-HPLC mit einer C18-Säule mit einer Durchflussrate von 0,42 Milliliter pro Minute und bei Einer Spaltentemperatur für 40 Grad Celsius ausführen. Verwenden Sie einen Dioden-Array-Detektor, um die zielgerichteten Aminosäuren mit 254 Nanometern zu erkennen und ihre Konzentrationen zu berechnen, indem Sie die Spitzenbereiche unter der Standardkurve kartieren. In dieser Studie werden Aminosäure-Overproduzenten identifiziert, indem seltene kodonreiche Marker verwendet werden, um gleichzeitig Genauigkeit, Empfindlichkeit und hohen Durchsatz zu erreichen.
Für das Selektionssystem sollte ein starker Rückgang der OD600 für Stämme beobachtet werden, die das seltene codonreiche Antibiotikaresistenzgen beherbergen, im Vergleich zu dem Stamm, der den Wildtyp beherbergt. Die Hemmung seltener Codon auf Proteinausdrücke erfolgt meist unter verhungerten Bedingungen. Nach zusätzlicher Fütterung der entsprechenden Aminosäure erhöht sich die OD600 für den Stamm, der das seltene codonreiche Antibiotikaresistenzgen beherbergt, deutlich an.
Für das Screening-System ist die Fluoreszenzintensität in der Anzahl der fluoreszierenden Zellen für den Stamm, der das fluoreszierende Protein aus dem seltenen codonreichen Gen ausdrückt, signifikant geringer als aus dem Wildtyp-Gen. Die Fütterung der entsprechenden Aminosäure wird Proteinausdrücke aus den seltenen codonreichen Genen wiederherstellen. Bei der Verwendung des violetten Proteins ist die Farbe, die sich aus dem seltenen codonreichen PPG entwickelt hat, leichter als die des Wildtyp-Gens.
Das unverdünnte LB-Medium ermöglicht eine langsame Expression des seltenen codonreichen PPG ohne L-Leucin-Fütterung im exprimierten violetten Protein, sobald die Zellen pelletiert sind. Dies verhehlt jedoch nicht, dass die Genexpression aus dem seltenen codonreichen PPG durch die Fütterung des L-Leucins verstärkt wird. Die seltene kodonbasierte Strategie könnte Überproduzenten der zielgerichteten Aminosäuren aus der Mutationsbibliothek identifizieren und diese Mutanten sollten höhere Mengen der zielgerichteten Aminosäuren produzieren als die Elternstämme.
Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, seltene Codon-Frequenz anzupassen, um eine klare Diskriminierung in der OD oder Farbe zwischen Zellen zu erreichen, die die Wildtyp-Marker und die seltenen codonreichen Derivate beherbergen. Die Transkriptomanalyse und die Genomsequenzierung könnten auf die ausgewählten Stämme angewendet werden, um den Mechanismus im Zusammenhang mit Aminosäureproduktionen zu untersuchen. Mit dieser Technik könnten Aminosäureüberproduzenten effizient identifiziert werden und die Analyse ihrer genetischen Informationen würde neue Einblicke in ihre Mechanismen hinter Aminosäureüberproduktionen bieten.
Die Aminosäurederivatisierung könnte schädlich sein. Achten Sie darauf, Handschuhe und die Schutzkleidung zu tragen und führen Sie diese Schritte in einer Dunstabzugshaube aus.
