반응성 산소 종 또는 ROS는 세포에 의해 생성되는 매우 반응성 산소 종이며, 그들의 행동에 영향을 미칩니다. 과잉 ROS는 또한 광범위 한 세포 혼란을 일으킬 수 있습니다 하지만, 그리고 심한 경우에, 세포 죽음. 따라서, ROS 항상성의 유지는 세포 기능 및 생존에 근본적으로 중요합니다.
여기에 제시된 프로토콜은, 미토콘드리아에 의해 생성되는 특정 유형의 ROS를 측정하는 데 초점을 맞추고 있으며, 주로 살아있는, 정상 또는 건강한 조혈 줄기 및 전구 세포 집단뿐만 아니라 혈액암, 급성 골수성 백혈병 또는 AML의 마우스 모델에서 백혈병 세포에서 대사 부산물로 서 발생합니다. 이 프로토콜은 또한 유전자 삭제 또는 과발현과 같은 유전 조작이 몇몇 건강하고 악성 조혈 인구에 있는 미토콘드리아 ROS에 어떻게 영향을 미치는지 평가하기 위하여 이용될 수 있습니다. 그리고 결과적으로, 잠재적으로 레두 상태 와 아마도 세포의 물질 대사에 대 한 통찰력 있는 정보를 제공.
이 기술은 살아있는 건강하고 악성 조혈 줄기 및 선조 하위 인구에서 미토콘드리아 ROS 생산을 모니터링하기 위해 프로토겐 프로브의 흐름 정착 메트릭 분석을 승인합니다. 이 프로토콜은 간단하며 몇 시간 안에 완료할 수 있습니다. 더욱이, 살아있는 세포 분석에 적합하며, 골수의 줄기 세포 집단에서 미토콘드리아 로스를 구별하고 분석할 수 있으며, 얼룩의 표면 마크를 이용하여.
원고에 따르면 야생 단단한 마우스및 백혈병 MLL-AF9 마우스로부터 단핵 골수 세포를 수집한 후, 9개의 단일 색 대조구 각각에 세포 현탁액의 200 마이크로리터를 알리쿼트. 다른 실험 관에 나머지 세포를 알리쿼트, 각각 200 마이크로 리터. 그런 다음 골수 세포와 백혈구를 각각 포함하는 원심분리기 2개의 실험관및 1개의 대조군 관으로 놓습니다.
원심분리기는 5분간 300배 G로 합니다. 다음으로, 제조 자의 지시에 따라, 상체를 데칭하고, 라이브 / 죽은 세포 얼룩으로 실온 F-PBS에서 세포를 다시 중단합니다. 얼음에 30분 간 배양하세요.
그 후, 3개의 라이브/데드 스테인드 튜브에 실온 F-PBS 1밀리리터를 추가하고, 미토콘드리아 ROS 염색을 위한 단일 컬러 제어 튜브를 추가합니다. 튜브를 원심분리기에 300배 G로 넣고 실온에서 5분간 넣습니다. 그런 다음, DMSO의 13 마이크로리터에서 미토콘드리아 ROS 염료 50 마이크로그램을 다시 일시 중단하여 5 밀리미터 미토콘드리아 ROS 염료 스톡 용액을 획득한다.
그런 다음 13 마이크로 리터 미토콘드리아 ROS 염료에 실온 F-PBS 13 밀리리터를 추가하여 5 마이크로 몰러의 최종 농도로 희석합니다. 필요한 경우 미토콘드리아 efflux 펌프를 억제하기 위해 50 밀리머 베라파밀13마이크로리터를 솔루션에 추가합니다. 원심분리기에서 튜브를 얻고 살아있는 / 죽은 세포 얼룩의 세척을 흡인.
라이브/데드 스테닝 컨트롤에 F-PBS 200 마이크로리터를 추가하고 분석을 시작할 준비가 될 때까지 얼음에 보관하십시오. 베라파밀을 함유한 미토콘드리아 ROS 염료 얼룩 200개, 각 실험 튜브, 미토콘드리아 ROS 염색 제어 튜브에 첨가한다. 소용돌이는 어둠 속에서 섭씨 37도에서 10 분 동안 혼합하고 배양합니다.
그런 다음 제어 및 실험 튜브에 실온 F-PBS 1 밀리리터를 추가합니다. 원심 분리기는 실온에서 300배 G로 5분 거리에 있습니다. 슈퍼나텐트를 흡습하고 실온 F-PBS1밀리리터로 셀을 세척합니다.
원심분리기는 실온에서 300배 G에서 5분간 다시 원심분리기를 사용할 수 있습니다. 첫째, 건강하고 백혈병 골수 세포를 위한 2개의 항체 칵테일을 준비합니다. 건강한 골수 세포를 포함하는 실험 관으로부터 상체를 흡인하고, 항체 칵테일 번호 1의 마이크로리터 를 튜브에 첨가한다.
혼합 소용돌이. 또한 F-PBS의 200 마이크로리터와 해당 항체의 1개의 마이크로리터를 추가하여 단일 색 제어 관을 준비한다. 어둠 속에서 얼음에 60 분 동안 배양.
백혈병 골수를 포함하는 실험관에서 초신자를 흡인시키고, 항체 칵테일 번호 2의 마이크로리터 200을 튜브에 추가합니다. 혼합 소용돌이. 어둠 속에서 얼음에 60 분 동안 배양.
그 후, 모든 튜브를 차가운 F-PBS와 원심분리기 1밀리리터로 실온에서 300배 G로 5분간 세척합니다. 감기 F-PBS의 500 마이크로 리터에서 세포를 다시 중단합니다. 체온을 제외하기 위한 40 마이크로미터 필터로 각 유량 사이토미터 튜브로 세포 현탁액을 전달합니다.
먼저, 유동 세포측정기에 얼룩 제어 튜브를 하나 도 삽입하고 유동 세포측정기의 보정을 위해 인수를 시작한다. 다른 제어 튜브에 대해 반복합니다. 그 후, 게이트를 설정하는 실험 튜브를 읽어보십시오.
세포 집단의 크기와 복잡성을 분석하기 위해 먼저 건강한 HSPC를 위해 전방 분산 영역과 측면 분산 영역 플롯 인구를 설정합니다. 스퀘어 게이트 버튼을 눌러 전방 및 측면 흩어진 플롯에서 불필요한 잔해를 문밖으로 내보세요. 그런 다음 전방 분산 영역과 높이 플롯에서 이중 차별을 사용하여 더블 을 게이트합니다.
라이브 셀, 계보 낮은 세포 및 다양한 건강한 HSPC를 선택합니다. 관심의 각 인구에 대해, 히스타그램 플롯에서 TRPE 채널의 중간 형광 강도를 분석하여 미토콘드리아 ROS 신호의 차이를 평가한다. 백혈병 인구를 위한 크기 분석, 게이팅 및 히스토그램 플롯의 동일한 절차를 반복합니다.
건강한 마우스로부터 분리된 골수 세포는 살아있는/죽은 염료및 미토콘드리아 ROS 염료로 염색되었고, 이어서 계보 마커를 인식하는 항체로 염색하였다: 플러스 CD48, C 키트, Sca-1, CD34 및 CD150. 또한, 백혈병 마우스로부터의 골수 세포는 또한 CD45.1로 염색된 건강한 수령인 골수 세포로부터 MLL-AF9 백혈병 세포를 구별하기 위해 CD45.2로 염색되었다. 건강한 CD48 네거티브 LSK와 골로이드 전구사이의 미토콘드리아 ROS 염색을 비교하면 골수성 전구가 미토콘드리아 ROS 염색 수준이 상당히 높은 것으로 나타났습니다.
더욱이, c-Kit 높은 백혈병 전구는 c-Kit 중간 낮은 백혈병 세포, 건강한 CD48 음성 LSK 및 골로이드 전조제에 비해 미토콘드리아 ROS 염색의 상당히 높은 수준을 표시합니다. C-Kit 중간 낮은 백혈병 세포, 또한 CD48 음성 LSK 세포에 비해 상당히 높은 값을 표시, 하지만 골수성 전조에. 미토콘드리아 ROS 염료는 반응성이 매우 높으며 다음 단계를 시작하기 전에 염료의 과잉이 제거되었는지 확인하기 위해 적절한 세척 단계가 필요합니다.
살아있는 조혈 세포에서 redux 상태의 지식의 비트를 달성하기 위해,이 프로토콜에 사용할 수있는 몇 가지 화학적으로 뚜렷한 ROS 불소 염료가 있습니다. 이 기술은 문학에서 광범위하게 사용되었으며, 정상 대응과 비교하면 백혈병 세포에서 분화되는 대사 및 신호 경로에 대한 유용한 통찰력을 제공 할 수 있습니다.
