Especies reactivas de oxígeno o ROS, son especies de oxígeno altamente reactivas que son producidas por las células, e influye en su comportamiento. Aunque el exceso de ROS también puede causar estragos celulares generalizados, y en casos graves, la muerte celular. Por lo tanto, el mantenimiento de la homeostasis ROS es de importancia fundamental para la función celular y la supervivencia.
El protocolo presentado aquí, se centra en la medición de un tipo específico de ROS, que es generado por las mitocondrias, principalmente como un subproducto metabólico en poblaciones de tallos y células promatopoyéticas vivos, normales o saludables, así como en células de leucemia del modelo de ratón de cáncer sanguíneo, leucemia mieloide aguda o LMA. Este protocolo también se puede utilizar para evaluar cómo la manipulación genética, como la deleción de genes o la sobreexpresión, afecta la ROS mitocondrial en varias poblaciones hematopoyéticas sanas y malignas. Y como resultado, potencialmente proporcionar información perspicaz sobre el estado de redux y posiblemente el metabolismo de las células.
Esta técnica autoriza el análisis métrico de asentamiento de flujo de una sonda protogénica para monitorear la producción de ROS mitocondrial en subpopoyéticas y tallos hematopoyéticos vivos sanos y malignos y subpoblaciones progenitoras. Este protocolo es sencillo y se puede completar en unas horas. Además, es adecuado para el análisis de células vivas y permite distinguir y analizar ROS mitocondrial en la población de células madre en la médula ósea, utilizando la marca superficial de tinción.
Después de recoger células mononucleares de médula ósea de ratones estrechos salvajes y ratones leucémicos MLL-AF9, según el manuscrito, aliquot 200 microlitros de la suspensión celular en cada uno de los nueve tubos de control de color único. Aliquot las células restantes en otros tubos experimentales, 200 microlitros cada uno. Luego coloque en una centrífuga dos tubos experimentales que contienen células de médula ósea y células leucémicas respectivamente, y un tubo de control.
Centrifugar a 300 veces G durante cinco minutos. A continuación, decantar el sobrenadante, y volver a suspender las células a temperatura ambiente F-PBS con una mancha de célula viva / muerta, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Incubar sobre hielo durante 30 minutos.
Después, agregue 1 mililitro de temperatura ambiente F-PBS a los tres tubos manchados vivos/muertos, y un solo tubo de control de color para la tinción de tinte ROS mitocondrial. Coloque los tubos en la centrífuga a 300 veces G durante cinco minutos a temperatura ambiente. A continuación, obtenga una solución de material de colorante ROS mitocondrial de 5 milimolar mediante la suspensión de 50 microgramos de colorante ROS mitocondrial en 13 microlitros de DMSO.
A continuación, añada 13 mililitros de F-PBS a temperatura ambiente al tinte ROS mitocondrial de 13 microlitros para diluir a una concentración final de cinco micromolares. Si es necesario, agregue 13 microlitros de 50 verapamilos mililares a la solución para inhibir las bombas de eflujo mitocondrial. Obtener los tubos de la centrífuga y aspirar el lavado de la mancha de células vivas / muertas.
Agregue 200 microlitros de F-PBS en el control de tinción vivo/muerto y manténgalo en hielo hasta que esté listo para iniciar el análisis. Añadir 200 microlitros de la mancha de tinte ROS mitocondrial que contiene Verapamil, a cada tubo experimental, así como el tubo de control de tinción ROS mitocondrial. Vórtice para mezclar e incubar durante 10 minutos a 37 grados centígrados en la oscuridad.
A continuación, agregue 1 mililitro de temperatura ambiente F-PBS al control y tubos experimentales. Centrifugar cinco minutos a 300 veces G a temperatura ambiente. Aspirar el sobrenadante y lavar las células con un mililitro adicional de temperatura ambiente F-PBS.
Centrifugar de nuevo durante cinco minutos a 300 veces G, a temperatura ambiente. En primer lugar, preparar dos cócteles de anticuerpos para las células de médula ósea sanas y de leucemia. Aspirar el sobrenadante del tubo experimental que contiene células sanas de la médula ósea, y añadir 200 microlitros del cóctel de anticuerpos número uno al tubo.
Vórtice para mezclar. También prepare los tubos de control de color único añadiendo 200 microlitros de F-PBS y un microlitro del anticuerpo correspondiente. Incubar durante 60 minutos sobre hielo en la oscuridad.
Aspirar el sobrenadante del tubo experimental que contiene la médula ósea de la leucemia, y añadir 200 microlitros del cóctel de anticuerpos número dos, al tubo. Vórtice para mezclar. Incubar durante 60 minutos sobre hielo en la oscuridad.
Después de eso, lave todos los tubos con 1 mililitro de F-PBS frío y centrífuga durante cinco minutos a 300 veces G a temperatura ambiente. Re-suspenda las células en 500 microlitros de F-PBS frío. Transfiera la suspensión celular a cada tubo de citometro de flujo con un filtro de 40 micrómetros para excluir agregados.
En primer lugar, inserte un tubo de control de manchas en la máquina de citometría de flujo e inicie la adquisición para compensar la máquina de citometría de flujo. Repita el procedimiento para otros tubos de control. Después, lea los tubos experimentales para instalar las puertas.
Para analizar el tamaño y la complejidad de la población celular, primero para HSPC sano, establezca el área de dispersión hacia adelante y las poblaciones de área de dispersión lateral. Pulse el botón Puerta cuadrada para alejar los escombros extraños de la gráfica de dispersión hacia adelante y lateral. A continuación, en un área de dispersión hacia delante y una gráfica de altura, utilice un doble discriminador para eliminar dobles.
Seleccione celdas vivas, células bajas de linaje y los diversos HSPC sanos. Para cada población de interés, analice la intensidad media de fluorescencia del canal TRPE en una gráfica de histagrama, para evaluar las diferencias en la señal ROS mitocondrial. Repita el mismo procedimiento de análisis de tamaño, medición e histograma de trazado para poblaciones de leucemia.
Las células de médula ósea aisladas de ratones sanos se tiñeban con un tinte vivo/muerto y un tinte ROS mitocondrial, y posteriormente se tiñeban con anticuerpos que reconociendo los marcadores de linaje: además de CD48, C-kit, Sca-1, CD34 y CD150. Además, las células de médula ósea de ratones con leucemia también fueron teñidas con CD45.2 para discriminar entre las células de leucemia MLL-AF9 de células de médula ósea receptoras sanas teñidas con CD45.1. Una comparación de la tinción de ROS mitocondrial, entre el LSK negativo CD48 saludable y los progenitores mieloides, muestra que los progenitores mieloides muestran niveles significativamente más altos de tinción DE ROS mitocondrial.
Además, los progenitores de alta leucemia de c-Kit muestran niveles significativamente más altos de tinción DE ROS mitocondrial, en comparación con las células intermedias de leucemia baja c-Kit, LSK negativo CD48 saludable y progenitores mieloides. Células intermedias de leucemia baja de C-Kit, también mostraron un valor significativamente mayor en comparación con las células LSK negativas CD48, pero no a los progenitores mieloides. Los tintes ROS mitocondriales son altamente reactivos y se necesitan pasos de lavado adecuados para asegurarse de que se ha eliminado cualquier exceso del tinte antes de comenzar los siguientes pasos.
Hay varios tintes fluorogénicos ROS químicamente distintos que se pueden utilizar en este protocolo, para lograr un poco de conocimiento del estado de redux en células hematopoyéticas vivas. Esta técnica se ha utilizado ampliamente en la literatura, y puede proporcionar información útil sobre las vías metabólicas y de señalización que se regulan diferencialmente en las células de leucemia, si se compara con sus homólogos normales.
