أنواع الأكسجين التفاعلية أو ROS ، هي أنواع الأكسجين التفاعلية للغاية التي تنتجها الخلايا ، وتؤثر على سلوكها. على الرغم من أن روز الزائدة يمكن أن يسبب أيضا الخراب الخلوية على نطاق واسع، وفي الحالات الشديدة، وفاة الخلايا. وبالتالي ، فإن الحفاظ على نظام التوازن ROS له أهمية أساسية لوظيفة الخلوية والبقاء على قيد الحياة.
البروتوكول المقدم هنا، يركز على قياس نوع محدد من ROS، التي يتم إنشاؤها بواسطة الميتوكوندريا، أساسا كمنتج عرضي الأيض في الحية، طبيعية، أو صحية الجذعية الدموية والخلايا السلف، وكذلك في خلايا سرطان الدم من نموذج الماوس لسرطان الدم، سرطان الدم النخاعي الحاد أو AML. ويمكن استخدام هذا البروتوكول أيضا لتقييم كيفية تأثير التلاعب الجيني، مثل حذف الجينات أو فرط التعبير، على الميتوكوندريا ROS في العديد من السكان الأصحاء والخبيثين لدم الدم. ونتيجة لذلك، يحتمل أن توفر معلومات الثاقبة حول الدولة redux وربما التمثيل الغذائي للخلايا.
هذه التقنية يأذن تدفق تسوية التحليل متري من مسبار protogenic لرصد إنتاج روس الميتوكوندريا في الحية صحية والخبيثة الجذعية الكبدية والنسل دون السكان. هذا البروتوكول هو مباشر ويمكن أن تكتمل في غضون ساعات قليلة. وعلاوة على ذلك، فإنه هو مناسبة لتحليل الخلايا الحية ويسمح لتمييز وتحليل ROS الميتوكوندريا في مجموعات الخلايا الجذعية في نخاع العظام، وذلك باستخدام علامة سطح تلطيخ.
بعد جمع خلايا نخاع العظام أحادية النية من الفئران الضيقة البرية وفئران MLL-AF9 للويوكيمي، وفقا للمخطوطة، aliquot 200 ميكرولترات من تعليق الخلية في كل من تسعة أنابيب تحكم لون واحد. Aliquot الخلايا المتبقية في أنابيب تجريبية أخرى، 200 ميكرولترات لكل من. ثم ضع في جهاز طرد مركزي أنبوبين تجريبيين يحتويان على خلايا نخاع العظم وخلايا اللوكيميا على التوالي، وأنبوب تحكم واحد.
جهاز طرد مركزي في 300 مرة G لمدة خمس دقائق. المقبل، decant المافق، وإعادة تعليق الخلايا في درجة حرارة الغرفة F-PBS مع بقعة خلية حية / ميتة، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. احتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة.
بعد ذلك، إضافة 1 ملليلتر من درجة حرارة الغرفة F-PBS إلى الأنابيب الثلاثة الملطخة الحية / الميتة، وأنبوب واحد للتحكم في اللون لتلطيخ صبغة الدايكة الوردية الميتوكوندريا. ضع الأنابيب في جهاز الطرد المركزي بمعدل 300 مرة من G لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم, الحصول على 5 ملولار الميتوكوندريا روس صبغ الأسهم حل عن طريق إعادة تعليق 50 ميكروغرام من صبغة روس الميتوكوندريا في 13 ميكرولترات من DMSO.
ثم إضافة 13 ملليلتر من درجة حرارة الغرفة F-PBS إلى صبغة 13 ميكرولتر روس للميتوكوندريا لتخفيف إلى تركيز نهائي من خمسة ميكرومولار. إذا لزم الأمر، إضافة 13 ميكرولترات من 50 ملليمتر فيراباميل إلى الحل لمنع مضخات الميتوكوندريا efflux. الحصول على أنابيب من جهاز الطرد المركزي وpirate قبالة غسل بقعة الخلية الحية / الميتة.
إضافة 200 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني F في السيطرة على تلطيخ حية / ميتة والاحتفاظ بها في الجليد حتى جاهزة لبدء التحليل. إضافة 200 ميكرولترات من وصمة عار صبغة روس الميتوكوندريا التي تحتوي على فيراباميل، إلى كل أنبوب تجريبي، فضلا عن أنبوب التحكم في تلطيخ الميتوكوندريا ROS. دوامة لخلط واحتضان لمدة 10 دقائق في 37 درجة مئوية في الظلام.
ثم إضافة 1 ملليلتر من درجة حرارة الغرفة F-PBS إلى التحكم والأنابيب التجريبية. جهاز طرد مركزي خمس دقائق في 300 مرة G في درجة حرارة الغرفة. التعرق قبالة supernatent وغسل الخلايا مع ملليلتر واحد إضافية من درجة حرارة الغرفة F-PBS.
أجهزة الطرد المركزي مرة أخرى لمدة خمس دقائق في 300 مرة G، في درجة حرارة الغرفة. أولاً، أعدّي كوكتيلات الجسم المضاد لخلايا نخاع العظام الصحية وسرطان الدم. اضمّر المُنْطَر من الأنبوب التجريبي الذي يحتوي على خلايا نخاع عظمي صحية، وأضف 200 ميكرولترات من كوكتيل الأجسام المضادة رقم واحد إلى الأنبوب.
دوامة لخلط. أيضا إعداد أنابيب التحكم اللون واحد عن طريق إضافة 200 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني F وميكر واحد من الأجسام المضادة المقابلة. احتضان لمدة 60 دقيقة على الجليد في الظلام.
اضمّر المُنْطَل من الأنبوب التجريبي الذي يحتوي على نخاع العظام لسرطان الدم، وأضيف 200 ميكرولترات من كوكتيل الأجسام المضادة رقم اثنين، إلى الأنبوب. دوامة لخلط. احتضان لمدة 60 دقيقة على الجليد في الظلام.
بعد ذلك، اغسل جميع الأنابيب بـ 1 ملليلتر من F-PBS الباردة والطرد المركزي لمدة خمس دقائق بمعدل 300 مرة في درجة حرارة الغرفة. إعادة تعليق الخلايا في 500 ميكرولترات من F-PBS الباردة. نقل تعليق الخلية إلى كل أنبوب تدفق مقياس الخلايا مع مرشح 40 ميكرومتر لاستبعاد المجاميع.
أولا، إدراج واحد أي أنبوب التحكم في وصمة عار في آلة تدفق القياسات اللوترية وبدء عملية الاستحواذ لتعويض تدفق آلة القياسات. كرر لأنابيب التحكم الأخرى. بعد ذلك، اقرأ الأنابيب التجريبية لإعداد البوابات.
لتحليل حجم وتعقيد مجموعة الخلايا ، أولاً من أجل HSPC صحية ، تعيين منطقة مبعثر إلى الأمام ومنطقة الجانب مبعثر مساحات السكان. اضغط على زر بوابة مربعة، إلى بوابة خارج الحطام الدخيلة من مؤامرة مبعثر إلى الأمام والجانب. ثم، على منطقة مبعثر إلى الأمام والمؤامرة الارتفاع، واستخدام التمييز المزدوج لبوابة من doublets.
حدد الخلايا الحية، والخلايا المنخفضة النسب، ومختلف HSPC صحية. لكل مجموعة من السكان من الفائدة، وتحليل متوسط كثافة الفلورنس من قناة TRPE في مؤامرة الهدوغرافية، لتقييم الاختلافات في إشارة ROS الميتوكوندريا. كرر نفس الإجراء من تحليل الحجم، والبوابات والجرات الرسم البياني التآمر للسكان سرطان الدم.
كانت خلايا نخاع العظام المعزولة عن الفئران السليمة ملطخة بصبغة حية / ميتة وصبغة روس الميتوكوندريا ، وتلطخت لاحقًا بأجساد مضادة تعترف بعلامات النسب: بالإضافة إلى CD48 و C-kit و Sca-1 و CD34 و CD150. بالإضافة إلى ذلك، كانت خلايا نخاع العظام من فئران سرطان الدم ملطخة أيضاً بـ CD45.2 للتمييز بين خلايا سرطان الدم MLL-AF9 من خلايا نخاع العظام السليمة الملطخة بـ CD45.1. مقارنة من تلطيخ ROS الميتوكوندريا, بين صحي CD48 LSK السلبية, ونسل النخاع, تبين أن النسل النخاعي عرض مستويات أعلى بكثير من تلطيخ ROS الميتوكوندريا.
وعلاوة على ذلك, ج كيت عالية سرطان الدم السلف عرض مستويات أعلى بكثير من تلطيخ ROS الميتوكوندريا, بالمقارنة مع c-كيت المتوسطة خلايا سرطان الدم منخفضة, صحي CD48 LSK السلبية ونسل النخاع. C-كيت المتوسطة خلايا سرطان الدم منخفضة, كما عرض قيمة أعلى بكثير بالمقارنة مع خلايا LSK السلبية CD48, ولكن ليس لنسل النخاع. أصباغ روس الميتوكوندريا هي عالية التفاعل وخطوات الغسيل المناسبة ضرورية لضمان إزالة أي فائض من الصبغة قبل البدء في الخطوات التالية.
هناك العديد من الأصباغ الفلوروجينية ROS متميزة كيميائيا التي يمكن استخدامها في هذا البروتوكول، لتحقيق قليلا من المعرفة من حالة redux في الخلايا الدموية الحية. وقد استخدمت هذه التقنية على نطاق واسع في الأدب، ويمكن أن توفر رؤى مفيدة على مسارات التمثيل الغذائي وإشارات التي يتم تنظيمها بشكل تفاضلي في خلايا سرطان الدم، إذا ما قورنت مع نظرائهم العاديين.
