Reaktif oksijen türleri veya ROS, hücreler tarafından üretilen son derece reaktif oksijen türleridir, ve davranışlarını etkiler. Aşırı ROS da yaygın hücresel hasara neden olabilir rağmen, ve ciddi durumlarda, hücre ölümü. Bu nedenle, ROS homeostaz Bakımı hücresel fonksiyon ve sağkalım için temel öneme sahiptir.
Burada sunulan protokol, mitokondri tarafından üretilen belirli bir ROS türünü ölçmeye odaklanır, özellikle canlı, normal veya sağlıklı hematopoetik kök ve döl hücre popülasyonlarında metabolik yan ürün olarak, ayrıca kan kanseri, Akut Miyeloid Lösemi veya AML fare modelinden lösemi hücrelerinde. Bu protokol aynı zamanda gen delemesi veya aşırı ekspresyonu gibi genetik manipülasyonun çeşitli sağlıklı ve malign hematopoetik popülasyonlarda mitokondriyal ROS'u nasıl etkilediğini değerlendirmek için de kullanılabilir. Ve sonuç olarak, potansiyel redux devlet ve muhtemelen hücrelerin metabolizması hakkında anlayışlı bilgi sağlar.
Bu teknik, canlı sağlıklı ve malign hematopoetik kök ve atayan alt popülasyonlarda mitokondriyal ROS üretimini izlemek için protojenik bir protojenik probun metrik analizini belirlemeyetkisine sahip. Bu protokol basittir ve birkaç saat içinde tamamlanabilir. Ayrıca, canlı hücre analizi için uygundur ve boyama yüzey işareti kullanarak, kemik iliğinde kök hücre popülasyonunda mitokondriyal ROS ayırt ve analiz sağlar.
Vahşi sıkı fareler ve lösemik MLL-AF9 farelerden mononükleer kemik iliği hücreleri toplandıktan sonra, el yazmasına göre, aliquot 200 dokuz tek renk kontrol tüpleri her içine hücre süspansiyon mikrolitre. Aliquot diğer deneysel tüpler, 200 mikrolitre her içine kalan hücreleri. Daha sonra sırasıyla kemik iliği hücreleri ve lösemik hücreler içeren bir santrifüj içine yerleştirin, ve bir kontrol tüpü.
5 dakika boyunca 300 kez G'de santrifüj. Daha sonra, supernatant decant ve üreticinin talimatlarına göre, canlı / ölü hücre lekesi ile oda sıcaklığında F-PBS hücreleri yeniden askıya. 30 dakika boyunca buzda kuluçkaya yat.
Daha sonra, üç canlı / ölü lekeli tüpler için oda sıcaklığında F-PBS 1 mililitre ekleyin ve mitokondriyal ROS boya boyama için tek bir renk kontrol tüpü. Tüpleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 300 kez G'de santrifüje yerleştirin. Daha sonra, DMSO'nun 13 mikrolitresinde 50 mikrogram mitokondriyal ROS boyasını yeniden askıya alarak 5 milimolar mitokondriyal ROS boya sıyrık çözeltisi elde edin.
Daha sonra 13 mikrolitre mitokondriyal ROS boyasına 13 mililitre oda sıcaklığında F-PBS ekleyin ve son konsantrasyonu beş mikromolar seyreltin. Gerekirse, mitokondriyal efflux pompaları inhibe etmek için çözeltiye 50 milimolar Verapamil 13 mikrolitre ekleyin. Tüpleri santrifüjden alın ve canlı/ölü hücre lekesinin yıkandığını aspire edin.
Canlı/ölü boyama kontrolüne 200 mikrolitre F-PBS ekleyin ve analize hazır olana kadar buzda tutun. Her deney tüpüne ve mitokondriyal ROS boyama kontrol tüpüne Verapamil içeren mitokondriyal ROS boya lekesinin 200 mikrolitresini ekleyin. Girdap karanlıkta 37 santigrat derece 10 dakika karıştırmak ve kuluçka.
Daha sonra kontrol ve deneysel tüpler e 1 mililitre oda sıcaklığında F-PBS ekleyin. Oda sıcaklığında 300 kez G'de beş dakika santrifüj. Supernatent kapalı Aspire ve oda sıcaklığında F-PBS ek bir mililitre ile hücreleri yıkayın.
Oda sıcaklığında, 300 kez G beş dakika için tekrar santrifüj. İlk olarak, sağlıklı ve lösemi kemik iliği hücreleri için iki antikor kokteyller hazırlamak. Sağlıklı kemik iliği hücreleri içeren deneysel tüpten süpernatant aspire ve tüp e bir numaralı antikor kokteyl 200 mikrolitre ekleyin.
Girdap karıştırmak için. Ayrıca f-PBS 200 mikrolitre ve ilgili antikor bir mikrolitre ekleyerek tek renk kontrol tüpleri hazırlamak. Karanlıkta buzda 60 dakika kuluçkaya yat.
Lösemi kemik iliği içeren deneysel tüpten süpernatant aspire, ve antikor kokteyl sayısı iki 200 mikrolitre ekleyin, tüp. Girdap karıştırmak için. Karanlıkta buzda 60 dakika kuluçkaya yat.
Bundan sonra, oda sıcaklığında 300 kez G beş dakika boyunca soğuk F-PBS ve santrifüj 1 mililitre ile tüm tüpleri yıkayın. 500 mikrolitre soğuk F-PBS'deki hücreleri yeniden askıya alın. Hücre süspansiyonuna, agregaları hariç tetmek için 40 mikrometre filtreyle her akış sitometre tüpüne aktarın.
İlk olarak, akış sitometri makinesiiçine bir leke kontrol tüpü yerleştirin ve akış sitometri makine telafi etmek için edinimi başlatmak. Diğer kontrol tüpleri için tekrarlayın. Daha sonra, kapıları kurmak için deneysel tüpleri okuyun.
Hücre popülasyonunun boyutunu ve karmaşıklığını analiz etmek için, önce sağlıklı HSPC için, ileri dağılım alanını ve yan dağılım alanını popülasyonları çizin. Kare Kapı düğmesine basın, ileri ve yan dağılım arsa gelen gereksiz enkaz dışarı kapı. Daha sonra, bir ileri dağılım alanı ve yükseklik arsa, doublets dışarı kapı için bir çift ayırıcı kullanın.
Canlı hücreleri, soyu düşük hücreleri ve çeşitli sağlıklı HSPC'yi seçin. Her ilgi çeken popülasyon için, mitokondriyal ROS sinyalindeki farklılıkları değerlendirmek için TRPE kanalının ortanca floresan yoğunluğunu bir historgram çiziminde analiz edin. Lösemi popülasyonları için boyut analizi, gating ve histogram çizimaynı prosedürü tekrarlayın.
Sağlıklı farelerden izole edilen kemik iliği hücreleri canlı/ölü boya ve mitokondriyal ROS boyası ile boyandı ve daha sonra soy belirteçlerini tanıyan antikorlarla boyandı: artı CD48, C-kit, Sca-1, CD34 ve CD150. Buna ek olarak, lösemi farelerin kemik iliği hücreleri de CD45.1 ile boyanmış sağlıklı alıcı kemik iliği hücrelerinden MLL-AF9 lösemi hücreleri arasında ayrım yapmak için CD45.2 ile lekelendi. Mitokondriyal ROS boyama bir karşılaştırma, sağlıklı CD48 negatif LSK arasında, ve miyeloid atalar, miyeloid atalarının mitokondriyal ROS boyama önemli ölçüde daha yüksek düzeyde görüntülemek gösterir.
Ayrıca, c-Kit yüksek lösemi ataları, c-Kit ara düşük lösemi hücreleri, sağlıklı CD48 negatif LSK ve miyeloid atalara göre önemli ölçüde daha yüksek düzeyde mitokondriyal ROS boyama gösterirler. C-Kit orta düşük lösemi hücreleri, ayrıca CD48 negatif LSK hücrelerine göre önemli ölçüde daha yüksek bir değer gösterdi, ama miyeloid atalara değil. Mitokondriyal ROS boyaları son derece reaktiftir ve aşağıdaki adımlara başlamadan önce boya fazlalığı giderildiğından emin olmak için uygun yıkama adımları gereklidir.
Canlı hematopoetik hücrelerde redux durumu hakkında biraz bilgi elde etmek için, bu protokolde kullanılabilecek birkaç kimyasal farklı ROS florojenik boyalar vardır. Bu teknik literatürde yaygın olarak kullanılmıştır ve normal muadilleriyle karşılaştırıldığında lösemi hücrelerinde farklı olarak düzenlenmiş metabolik ve sinyal yolları hakkında yararlı bilgiler sağlayabilir.
