活性酸素種またはROSは、細胞によって産生される活性酸素種であり、その行動に影響を与える。過剰なROSはまた、広範囲にわたる細胞大混乱を引き起こす可能性がありますが、重症例では、細胞死。したがって、ROS恒常性の維持は、細胞機能および生存にとって基本的に重要である。
ここで提示されるプロトコルは、ミトコンドリアによって生成される特定のタイプのROSの測定に焦点を当てています, 主に生きている、正常な、または健康な造血幹細胞および前駆細胞集団の代謝副産物として, ならびに血液癌のマウスモデルからの白血病細胞で, 急性骨髄性白血病またはAML.このプロトコルは、遺伝子欠失や過剰発現などの遺伝子操作が、いくつかの健康で悪性造血集団におけるミトコンドリアROSにどのような影響を与えるかを評価するためにも使用できます。その結果、リダックス状態と細胞の代謝に関する洞察に満ちた情報を提供する可能性があります。
この技術は、原性プローブのフロー決済メトリック分析を承認し、生きている健康で悪性造血性茎および前駆体亜集団におけるミトコンドリアROS産生を監視する。このプロトコルは簡単で、数時間で完了できます。さらに、生細胞分析に適しており、染色の表面マークを使用して、骨髄中の幹細胞集団におけるミトコンドリアROSを区別し、分析することができます。
原稿によると、野生のタイトマウスおよび白血病MLL-AF9マウスから単核骨髄細胞を採取した後、9つの単色制御チューブのそれぞれに細胞懸濁液の200マイクロリットルをアリコートした。残りの細胞を他の実験管にアリコートし、それぞれ200マイクロリットルを含む。次に、それぞれ骨髄細胞と白血病細胞を含む2つの実験チューブと1つのコントロールチューブを遠心分離機に入れる。
5分間Gの300倍で遠心分離機。次に、上清をデカントし、メーカーの指示に従って、生きている/死んだ細胞染色で室温F-PBSの細胞を再中断します。氷の上で30分間インキュベートします。
その後、3本の生きた染色チューブに室温F-PBSを1ミリリットル加え、ミトコンドリアROS染料染色用の単色制御チューブを1本加えます。チューブを室温で5分間Gの300倍の遠心分離機に入れます。次いで、50マイクログラムのミトコンドリアROS染料をDMSOの13マイクロリットルに再懸濁させることにより、5ミリモルミトコンドリアROS染料のストック溶液を得る。
その後、13マイクロリットルミトコンドリアROS染料に室温F-PBSの13ミリリットルを加え、5マイクロモルの最終濃度に希釈します。必要に応じて、ミトコンドリア流出ポンプを阻害する溶液に50ミリモルベラパミルの13マイクロリットルを加えます。遠心分離機からチューブを入手し、生きた/死んだ細胞染色の洗浄を吸引します。
ライブ/デッド染色制御に200マイクロリットルのF-PBSを加え、分析を開始する準備ができるまで氷の中に保管します。ベラパミルを含むミトコンドリアROS色素染色剤200マイクロリットルを各実験チューブ、ならびにミトコンドリアROS染色制御チューブに加える。渦は、暗闇の中で摂氏37度で10分間混合してインキュベートします。
次に、1ミリリットルの室温F-PBSを制御チューブおよび実験管に加えます。遠心分離機は室温で300倍Gで5分間。スーパーナテントを吸引し、室温F-PBSの追加1ミリリットルで細胞を洗います。
室温で300倍Gで5分間再び遠心分離機。まず、健康な骨髄細胞と白血病の骨髄細胞に対して2つの抗体カクテルを調製する。健康な骨髄細胞を含む実験管から上澄み物を吸引し、200マイクロリットルの抗体カクテル1をチューブに加えた。
混ぜる渦。また、F-PBSの200マイクロリットルと対応する抗体の1マイクロリットルを加えることによって単色制御チューブを調製する。暗闇の中で氷の上で60分間インキュベートします。
白血病骨髄を含む実験管から上澄を吸引し、抗体カクテル2の200マイクロリットルを加え、チューブに加える。混ぜる渦。暗闇の中で氷の上で60分間インキュベートします。
その後、冷たいF-PBSと遠心分離機を1ミリリットルで全管を室温で300倍Gで5分間洗浄します。500マイクロリットルの冷たいF-PBSで細胞を再懸濁する。細胞懸濁液を、凝集体を除外するための40マイクロメートルフィルターを用いて、各フローサイトメーターチューブに移します。
まず、フローサイトメトリーマシンに染色制御チューブを挿入し、取得を開始してフローサイトメトリーマシンを補償します。他のコントロールチューブについても繰り返します。その後、ゲートを設定するために実験管を読みます。
細胞集団のサイズと複雑さを分析するには、まず健康な HSPC の場合、前方散乱領域と側面散乱領域をプロットする母集団を設定します。正方形のゲートボタンを押して、前方および側面の散布図から余分な破片をゲートアウトします。次に、前方散乱領域と高さプロットで、二重識別子を使用してダブレットをゲートアウトします。
生細胞、系統低細胞、および様々な健康なHSPCを選択します。対象の各集団について、ヒスタグラムプロットにおけるTRPEチャネルの蛍光強度の中央値を分析し、ミトコンドリアROSシグナルの差を評価する。白血病集団のサイズ分析、格子、ヒストグラムプロットの同じ手順を繰り返します。
健康なマウスから分離された骨髄細胞は、生きた/死んだ色素とミトコンドリアROS色素で染色され、その後、CD48、C-kit、Sca-1、CD34およびCD150を認識する抗体で染色された。また、白血病マウス由来の骨髄細胞もCD45.2で染色し、CD45.1で染色された健常レシピ骨髄細胞からMLL-AF9白血病細胞を判別した。健康なCD48陰性LSKと骨髄性前駆腫との間のミトコンドリアROS染色の比較は、骨髄性前駆腫がミトコンドリアROS染色の有意に高いレベルを示すことを示している。
さらに、c-Kit高白血病前駆物質は、c-Kit中間低白血病細胞、健康CD48陰性LSKおよび骨髄性前駆細胞と比較して、ミトコンドリアROS染色の有意に高いレベルを表示する。Cキット中間低白血病細胞は、また、CD48陰性LSK細胞と比較して有意に高い値を示したが、骨髄性前駆細胞には表示されなかった。ミトコンドリアROS染料は反応性が高く、次の手順を開始する前に色素の過剰を除去するために適切な洗浄工程が必要です。
このプロトコルで使用できる化学的に異なるROS蛍光色素染料がいくつかあり、生造血細胞におけるredux状態の知識を少し得る。この技術は、文献で広く使用されており、正常な対応と比較した場合、白血病細胞で差有分調節される代謝およびシグナル伝達経路に関する有用な洞察を提供する可能性がある。
