מיני חמצן תגובתי או ROS, הם מיני חמצן תגובתי מאוד המיוצרים על ידי תאים, ומשפיע על התנהגותם. למרות עודף ROS יכול גם לגרום הרס תאי נרחב, במקרים חמורים, מוות תאי. לכן, התחזוקה של הוקמפוס ROS היא בעלת חשיבות בסיסית לתפקוד הסלולר והישרדות.
הפרוטוקול המוצג כאן, מתמקד במדידת סוג מסוים של ROS, שנוצר על ידי מיטוכונדריה, בעיקר כמוצר משנה מטבולי בגזע חי, נורמלי, או בריא hematopoietic גזע אוכלוסיות תאים אבי, כמו גם בתאי לוקמיה ממודל העכבר של סרטן הדם, לוקמיה מיאלואידית חריפה או AML. פרוטוקול זה יכול לשמש גם כדי להעריך כיצד מניפולציה גנטית, כגון מחיקת גנים או לחץ יתר, משפיעה על ROS המיטוכונדריאלי במספר אוכלוסיות hematopoietic בריאים ממאירים. וכתוצאה מכך, פוטנציאל לספק מידע תובנה על מצב redux ואולי חילוף החומרים של התאים.
טכניקה זו מאשרת ניתוח מטרי של גשוש פרוטוגניים כדי לפקח על ייצור ROS מיטוכונדריאלי בגזע ההמוטופיאטי בריא וממאאיר חי ותת-אוכלוסיות של צאצאים. פרוטוקול זה הוא פשוט ו ניתן להשלים אותו בעוד מספר שעות. יתר על כן, הוא מתאים לניתוח תאים חיים ומאפשר להבחין ולנתח ROS מיטוכונדריאלי באוכלוסיית תאי גזע במח העצם, באמצעות סימן פני השטח של כתמים.
לאחר איסוף תאי מח עצם מונונוקליריים מעכברים הדוקים פראיים ועכברי MLL-AF9 לויקמיים, על פי כתב היד, aliquot 200 microliters של ההשעיה התא לתוך כל אחד מתשעה צינורות בקרת צבע יחיד. עלה על התאים הנותרים לצינורות ניסוי אחרים, 200 מיקרוליטרים כל אחד. לאחר מכן מניחים לתוך צנטריפוגה שני צינורות ניסיוניים המכילים תאי מח עצם ותאים לויקמיים בהתאמה, וצינור בקרה אחד.
צנטריפוגה ב 300 פעמים G במשך חמש דקות. לאחר מכן, decant supernatant, ולהשעות מחדש את התאים בטמפרטורת החדר F-PBS עם כתם תא חי / מת, על פי הוראות היצרן. דגירה על קרח במשך 30 דקות.
לאחר מכן, הוסיפו מיליליטר של טמפרטורת החדר F-PBS לשלושת הצינורות המוכתמים חיים/מתים, וצינור בקרה אחד בצבע יחיד להכתמת צבע ROS מיטוכונדריאלי. מניחים את הצינורות לתוך הצנטריפוגה ב 300 פעמים G במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, להשיג 5 מילימולרי פתרון מלאי צבע ROS מיטוכונדריאלי על ידי השעיה מחדש 50 מיקרוגרם של צבע ROS מיטוכונדריאלי ב 13 microliters של DMSO.
לאחר מכן הוסיפו 13 מיליליטר של טמפרטורת החדר F-PBS לצבע ROS המיטוכונדריאלי 13 מיקרוליטר כדי לדלל לריכוז סופי של חמישה מיקרומולרים. במידת הצורך, להוסיף 13 microliters של 50 מילימול Verapamil לפתרון כדי לעכב משאבות efflux מיטוכונדריאלי. להשיג את הצינורות מן הצנטריפוגה ולשאוף את לשטוף את הכתם תא חי / מת.
הוסף 200 microliters של F-PBS בבקרת הכתמים חיים / מתים ולשמור אותו בקרח עד מוכן להתחיל את הניתוח. הוסף 200 microliters של כתם צבע ROS המיטוכונדריאלי המכיל Verapamil, לכל צינור ניסיוני, כמו גם את צינור בקרת הכתמים ROS המיטוכונדריאלי. מערבולת לערבב דגירה במשך 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס בחושך.
לאחר מכן הוסיפו מיליליטר של טמפרטורת החדר F-PBS לבקרה ולצינורות הניסוי. צנטריפוגה חמש דקות ב 300 פעמים G בטמפרטורת החדר. שאפו את העל-טבעי ושטפו את התאים במיליליטר נוסף של טמפרטורת החדר F-PBS.
צנטריפוגה שוב במשך חמש דקות ב 300 פעמים G, בטמפרטורת החדר. ראשית, להכין שני קוקטיילים נוגדנים לתאי מח עצם בריאים לוקמיה. שאפו את העל-טבעי מהצינור הניסיוני המכיל תאי מח עצם בריאים, והוסיפו לצינור 200 מיקרוליטרים של קוקטייל הנוגדנים מספר אחת.
וורטקס לערבב. כמו כן להכין את צינורות בקרת צבע יחיד על ידי הוספת 200 microliters של F-PBS ומיקרוליטר אחד של הנוגדן המתאים. דגירה במשך 60 דקות על קרח בחושך.
שאפו את העל-טבעי מהצינור הניסיוני המכיל מח עצם לוקמיה, והוסיפו לצינור 200 מיקרוליטרים של קוקטייל הנוגדנים מספר שתיים. וורטקס לערבב. דגירה במשך 60 דקות על קרח בחושך.
לאחר מכן, לשטוף את כל הצינורות עם 1 מיליליטר של F-PBS קר צנטריפוגה במשך חמש דקות ב 300 פעמים G בטמפרטורת החדר. להשעות מחדש את התאים ב 500 microliters של F-PBS קר. העבר את מתלי התא לתוך כל צינור ציטומטר זרימה עם מסנן 40 מיקרומטר עבור אי הכללת אגרגטים.
ראשית, להכניס אחד אין צינור בקרת כתם לתוך מכונת cytometry זרימה ולהתחיל את הרכישה כדי לפצות על מכונת cytometry זרימה. חזור על הפעולה עבור צינורות בקרה אחרים. לאחר מכן, קרא את צינורות הניסוי כדי להקים את השערים.
כדי לנתח את הגודל והמורכבות של אוכלוסיית התאים, תחילה עבור HSPC בריא, הגדר את אזור פיזור קדימה ואת אזור פיזור הצד חלקות אוכלוסיות. לחץ על כפתור השער המרובע, כדי לשער פסולת מיותרת מהמגרש של פיזור קדימה וצד. לאחר מכן, באזור פיזור קדמי ובמגרש גובה, השתמש במבדיל כפול כדי לתפוז כפילים.
בחר תאים חיים, תאים נמוכים שושלת, ואת HSPC בריא שונים. עבור כל אוכלוסייה של עניין, לנתח את עוצמת הפלואורסצנטיות החציונית של ערוץ TRPE בעלילת היסטגרם, כדי להעריך את ההבדלים באות ROS המיטוכונדריאלי. חזור על אותו הליך של ניתוח גודל, gating והיסטוגרמה התוויית עבור אוכלוסיות לוקמיה.
תאי מח עצם מבודדים מעכברים בריאים היו מוכתמים בצבע חי/מת וצבע ROS מיטוכונדריאלי, ולאחר מכן מוכתמים בנוגדנים המכירים סמני שושלת:בתוספת CD48, C-kit, Sca-1, CD34 ו- CD150. בנוסף, תאי מח עצם מעכברי לוקמיה היו מוכתמים גם ב- CD45.2 כדי להפלות בין תאי לוקמיה MLL-AF9 מתאים בריאים למח העצם מוכתמים ב- CD45.1. השוואה של כתמי ROS מיטוכונדריאליים, בין LSK שלילי CD48 בריא, לבין מיאלואידים, מראה כי מיאלואידים progenitors להציג רמות גבוהות באופן משמעותי של כתמי ROS מיטוכונדריאלי.
יתר על כן, c-Kit לויקמיה גבוהה progenitors להציג רמות גבוהות באופן משמעותי של כתמי ROS מיטוכונדריאלי, לעומת c-Kit בינוני תאים לוקמיה נמוכה, LSK שלילי CD48 בריא, מיאלואידים. C-Kit ביניים תאי לוקמיה נמוכה, גם הציג ערך גבוה משמעותית בהשוואה לתאי LSK שליליים CD48, אבל לא לאב מיאלואידים. צבעי ROS מיטוכונדריאלי מגיבים מאוד ויש צורך בצעדי שטיפה מתאימים כדי להבטיח שכל עודף של הצבע הוסר לפני תחילת השלבים הבאים.
ישנם מספר צבעים פלואורוגניים ROS ברור מבחינה כימית שניתן להשתמש בהם בפרוטוקול זה, כדי להשיג קצת ידע על מצב redux בתאים hematopoietic חיים. טכניקה זו שימשה בהרחבה בספרות, ועשויה לספק תובנות שימושיות על מסלולי חילוף החומרים ואיתות כי הם מוסדרים באופן דיפרנציאלי בתאי לוקמיה, אם בהשוואה לעמיתיהם הרגילים.
