Espécies reativas de oxigênio ou ROS, são espécies de oxigênio altamente reativas que são produzidas por células, e influencia seu comportamento. Embora o excesso de ROS também possa causar estragos celulares generalizados, e em casos graves, morte celular. Assim, a manutenção da homeostase ROS é de fundamental importância para a função celular e a sobrevivência.
O protocolo aqui apresentado, foca na medição de um tipo específico de ROS, que é gerado por mitocôndrias, principalmente como subproduto metabólico em populações de células hematopoiéticas vivas, normais ou saudáveis, bem como em células de leucemia do modelo de camundongos de câncer de sangue, Leucemia Mielóide Aguda ou LMA. Este protocolo também pode ser usado para avaliar como a manipulação genética, como a exclusão genética ou a superexpressão, impacta a ROS mitocondrial em várias populações hematopoiéticas saudáveis e malignas. E como resultado, potencialmente fornecer informações perspicazes sobre o estado redux e possivelmente o metabolismo das células.
Esta técnica autoriza a análise métrica de liquidação de fluxo de uma sonda protogênica para monitorar a produção de ROS mitocondrial em hastes hematopoiéticas vivas e malignas e sub-populações progenitoras. Este protocolo é simples e pode ser concluído em poucas horas. Além disso, é adequado para análise de células vivas e permite distinguir e analisar ros mitocondrial na população de células-tronco na medula óssea, utilizando marca superficial de coloração.
Depois de coletar células mononucleares de medula óssea de camundongos selvagens e camundongos MLL-AF9 leucômicos, de acordo com o manuscrito, aliquot 200 microliters da suspensão celular em cada um dos nove tubos de controle de cor única. Alíquotar as células restantes em outros tubos experimentais, 200 microliters cada. Em seguida, coloque em uma centrífuga dois tubos experimentais contendo células de medula óssea e células leucêmicas, respectivamente, e um tubo de controle.
Centrifugar a 300 vezes G por cinco minutos. Em seguida, decante o supernasce, e suspenda as células em temperatura ambiente F-PBS com uma mancha de célula viva/morta, de acordo com as instruções do fabricante. Incubar no gelo por 30 minutos.
Depois, adicione 1 mililitro de F-PBS de temperatura ambiente aos três tubos manchados vivos/mortos, e um único tubo de controle de cor para coloração mitocondrial ros. Coloque os tubos na centrífuga a 300 vezes G durante cinco minutos em temperatura ambiente. Em seguida, obtenha uma solução de estoque de corante ROS mitocondrial de 5 milimolar suspensa, suspendendo novamente 50 microgramas de corante ROS mitocondrial em 13 microliters de DMSO.
Em seguida, adicione 13 mililitros de temperatura ambiente F-PBS ao corante ROS mitocondrial de 13 microliteres para diluir a uma concentração final de cinco micromolares. Se necessário, adicione 13 microlitadores de 50 milimães Verapamil à solução para inibir bombas efflux mitocondrial. Obtenha os tubos da centrífuga e aspire a lavagem da mancha de célula viva/morta.
Adicione 200 microliters de F-PBS no controle de coloração ao vivo/morto e mantenha-o no gelo até que esteja pronto para iniciar a análise. Adicione 200 microliters da mancha de corante ROS mitocondrial contendo Verapamil, a cada tubo experimental, bem como o tubo de controle de manchas ROS mitocondrial. Vórtice para misturar e incubar por 10 minutos a 37 graus Celsius no escuro.
Em seguida, adicione 1 mililitro de F-PBS de temperatura ambiente ao controle e tubos experimentais. Centrífuga cinco minutos a 300 vezes G à temperatura ambiente. Aspire fora do supernamento e lave as células com um mililitro adicional de temperatura ambiente F-PBS.
Centrifugar novamente por cinco minutos a 300 vezes G, em temperatura ambiente. Primeiro, prepare dois coquetéis de anticorpos para células saudáveis e leucemias de medula óssea. Aspire o supernaente do tubo experimental contendo células saudáveis da medula óssea, e adicione 200 microliters do coquetel de anticorpos número um ao tubo.
Vórtice para misturar. Prepare também os tubos de controle de cor única adicionando 200 microliters de F-PBS e um microliter do anticorpo correspondente. Incubar por 60 minutos no gelo no escuro.
Aspire o supernaente do tubo experimental contendo leucemia medula óssea, e adicione 200 microliters do coquetel de anticorpos número dois, ao tubo. Vórtice para misturar. Incubar por 60 minutos no gelo no escuro.
Depois disso, lave todos os tubos com 1 mililitro de F-PBS frio e centrífuga por cinco minutos a 300 vezes G em temperatura ambiente. Suspenda as células em 500 microliters de F-PBS frios. Transfira a suspensão celular para cada tubo de citômetro de fluxo com um filtro de 40 micrômetros para excluir agregados.
Primeiro, insira um tubo de controle de manchas na máquina de citometria de fluxo e inicie a aquisição para compensar a máquina de citometria de fluxo. Repita para outros tubos de controle. Depois, leia os tubos experimentais para montar os portões.
Para analisar o tamanho e a complexidade da população celular, primeiro para o HSPC saudável, defina a área de dispersão para a frente e as populações de áreas de dispersão lateral. Pressione o botão Square Gate, para retirar detritos ímpares do gráfico de dispersão para a frente e para o lado. Em seguida, em uma área de dispersão para a frente e parcela de altura, use um discriminador duplo para gate out doublets.
Selecione células vivas, células baixas de linhagem e os vários HSPC saudáveis. Para cada população de interesse, analise a intensidade mediana da fluorescência do canal TRPE em um lote de histagram, para avaliar diferenças no sinal ROS mitocondrial. Repita o mesmo procedimento de análise de tamanho, gating e histograma traçando para populações de leucemia.
As células de medula óssea isoladas de camundongos saudáveis foram manchadas com um corante ros vivo/morto e um corante ROS mitocondrial, e posteriormente manchadas com anticorpos reconhecendo marcadores de linhagem:plus CD48, C-kit, Sca-1, CD34 e CD150. Além disso, as células de medula óssea de camundongos com leucemia também foram manchadas com CD45.2 para discriminar entre células de leucemia MLL-AF9 de células de medula óssea saudáveis manchadas com CD45.1. Uma comparação da coloração ros mitocondrial, entre LSK negativo CD48 saudável e progenitores mieloides, mostra que os progenitores mieloides apresentam níveis significativamente mais elevados de coloração ros mitocondrial.
Além disso, os progenitores de leucemia c-Kit apresentam níveis significativamente mais elevados de coloração ros mitocondrial, em comparação com células de baixa leucemia intermediárias c-Kit, LSK negativo CD48 saudável e progenitores mieloides. C-Kit células intermediárias de baixa leucemia, também apresentaram um valor significativamente maior em comparação com as células LSK negativas CD48, mas não para progenitores mieloides. Os corantes ROS mitocondrial são altamente reativos e são necessários passos de lavagem apropriados para garantir que qualquer excesso do corante tenha sido removido antes de iniciar as etapas seguintes.
Existem vários corantes fluorogênicos ROS quimicamente distintos que podem ser usados neste protocolo, para obter um pouco de conhecimento do status redux em células hematopoiéticas vivas. Esta técnica tem sido amplamente utilizada na literatura, podendo fornecer insights úteis sobre as vias metabólicas e de sinalização que são reguladas diferencialmente em células de leucemia, se comparadas com suas contrapartes normais.
