Les espèces réactives d’oxygène ou ROS, sont des espèces d’oxygène hautement réactives qui sont produites par les cellules, et influencent leur comportement. Bien que l’excès ros peut également causer des ravages cellulaires répandus, et dans les cas graves, la mort cellulaire. Ainsi, le maintien de l’homéostasie ROS est d’une importance fondamentale pour la fonction cellulaire et la survie.
Le protocole présenté ici, se concentre sur la mesure d’un type spécifique de ROS, qui est généré par les mitochondries, principalement comme un sous-produit métabolique dans les populations vivantes, normales ou saines de tige hématopoïétique et de cellules progénitrices, ainsi que dans les cellules leucémiques du modèle de souris du cancer du sang, la leucémie myéloïde aiguë ou la LAM. Ce protocole peut également être utilisé pour évaluer comment la manipulation génétique, comme la suppression ou la surexpression des gènes, affecte le ROS mitochondrial dans plusieurs populations hématopoïétiques saines et malignes. Et en conséquence, potentiellement fournir des informations perspicaces sur l’état redux et peut-être le métabolisme des cellules.
Cette technique autorise l’analyse métrique de régler le flux d’une sonde protogénique pour surveiller la production mitochondriale de ROS dans les sous-populations vivantes saines et malignes de tige hématopoïétique et d’ancêtre. Ce protocole est simple et peut être complété en quelques heures. En outre, il convient à l’analyse des cellules vivantes et permet de distinguer et d’analyser ros mitochondrial dans la population de cellules souches dans la moelle osseuse, en utilisant la marque de surface de la coloration.
Après avoir recueilli des cellules de moelle osseuse mononucléaire à partir de souris sauvages serrées et de souris leucémiques MLL-AF9, selon le manuscrit, aliquot 200 microlitres de la suspension cellulaire dans chacun des neuf tubes de contrôle de couleur unique. Aliquot les cellules restantes dans d’autres tubes expérimentaux, 200 microlitres chacun. Ensuite, placez dans une centrifugeuse deux tubes expérimentaux contenant respectivement des cellules de moelle osseuse et des cellules leucémiques, et un tube de contrôle.
Centrifugeuse à 300 fois G pendant cinq minutes. Ensuite, décanter le surnatant, et re-suspendre les cellules à température ambiante F-PBS avec une tache de cellule vivante / morte, selon les instructions du fabricant. Incuber sur la glace pendant 30 minutes.
Ensuite, ajoutez 1 millilitre de température ambiante F-PBS aux trois tubes tachés vivants/morts, et un seul tube de contrôle de couleur pour la coloration mitochondrique de teinture ROS. Placer les tubes dans la centrifugeuse à 300 fois G pendant cinq minutes à température ambiante. Ensuite, obtenez une solution de stock de teinture ROS mitochondriale de 5 millimolaires en suspendant 50 microgrammes de colorant ROS mitochondrial dans 13 microlitres de DMSO.
Ajouter ensuite 13 millilitres de F-PBS à température ambiante au colorant ROS mitochondrial de 13 microlitres pour les diluer jusqu’à une concentration finale de cinq micromolaires. Si nécessaire, ajouter 13 microlitres de Verapamil de 50 millimules à la solution pour inhiber les pompes à efflux mitochondriales. Obtenez les tubes de la centrifugeuse et aspirez le lavage de la tache de cellule vivante/morte.
Ajouter 200 microlitres de F-PBS dans le contrôle des taches vivantes/mortes et les garder dans la glace jusqu’à ce qu’ils soient prêts à commencer l’analyse. Ajouter 200 microlitres de la tache mitochondriale de colorant ROS contenant verapamil, à chaque tube expérimental, ainsi que le tube mitochondrial de contrôle de coloration ROS. Vortex pour mélanger et incuber pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius dans l’obscurité.
Ajoutez ensuite 1 millilitre de température ambiante F-PBS aux tubes de commande et expérimentaux. Centrifugeuse cinq minutes à 300 fois G à température ambiante. Aspirez le supernatent et lavez les cellules avec un millilitre supplémentaire de température ambiante F-PBS.
Centrifugeuse à nouveau pendant cinq minutes à 300 fois G, à température ambiante. Tout d’abord, préparer deux cocktails d’anticorps pour les cellules saines et leucémie de moelle osseuse. Aspirez le supernatant du tube expérimental contenant des cellules saines de moelle osseuse, et ajoutez 200 microlitres du cocktail d’anticorps numéro un au tube.
Vortex à mélanger. Préparez également les tubes de contrôle de couleur unique en ajoutant 200 microlitres de F-PBS et un microlitre de l’anticorps correspondant. Incuber pendant 60 minutes sur la glace dans le noir.
Aspirer le supernatant du tube expérimental contenant de la moelle osseuse leucémie, et ajouter 200 microlitres du cocktail anticorps numéro deux, au tube. Vortex à mélanger. Incuber pendant 60 minutes sur la glace dans le noir.
Après cela, laver tous les tubes avec 1 millilitre de F-PBS froid et centrifugeuse pendant cinq minutes à 300 fois G à température ambiante. Suspendre à nouveau les cellules dans 500 microlitres de F-PBS froid. Transférer la suspension cellulaire dans chaque tube de cytomètre d’écoulement à l’aide d’un filtre de 40 micromètres pour exclure les agrégats.
Tout d’abord, insérez-en un sans tube de contrôle des taches dans la machine de cytométrie d’écoulement et commencez l’acquisition pour compenser la machine de cytométrie d’écoulement. Répétez l’répétition pour d’autres tubes de commande. Ensuite, lisez les tubes expérimentaux pour installer les portes.
Analyser la taille et la complexité de la population cellulaire, d’abord pour un HSPC sain, définir la zone de dispersion vers l’avant et les populations de parcelles latérales de dispersion. Appuyez sur le bouton Square Gate, pour enlever les débris extérieurs de la parcelle de dispersion avant et latérale. Ensuite, sur une zone de dispersion vers l’avant et une parcelle de hauteur, utilisez un double discriminatoire pour sortir les doublets.
Sélectionnez les cellules vivantes, les cellules basses de lignée, et les divers HSPC sains. Pour chaque population d’intérêt, analyser l’intensité médiane de fluorescence du canal TRPE dans une parcelle d’histagramme, afin d’évaluer les différences dans le signal ROS mitochondrial. Répétez la même procédure d’analyse de taille, de gating et d’histogramme pour les populations de leucémie.
Des cellules de moelle isolées des souris saines ont été souillées avec un colorant vivant/mort et un colorant mitochondrial de ROS, et plus tard tachées avec des anticorps reconnaissant des marqueurs de lignée : plus CD48, C-kit, Sca-1, CD34 et CD150. En outre, les cellules de moelle osseuse des souris de leucémie ont également été souillées avec CD45.2 pour discriminer entre les cellules leucémiques de MLL-AF9 des cellules saines de moelle osseuse de destinataire souillées avec CD45.1. Une comparaison de la coloration mitochondrique de ROS, entre le LSK négatif sain de CD48, et les progéniteurs myéloïdes, montre que les progéniteurs myéloïdes affichent des niveaux sensiblement plus élevés de coloration mitochondrique de ROS.
En outre, les progéniteurs élevés de leucémie de c-Kit affichent des niveaux sensiblement plus élevés de coloration mitochondrique de ROS, comparés aux cellules basses leucémiques intermédiaires de c-Kit, au LSK négatif sain de CD48 et aux progéniteurs myéloïdes. Les cellules à faible leucémie intermédiaires C-Kit ont également affiché une valeur significativement plus élevée par rapport aux cellules LSK négatives CD48, mais pas aux progéniteurs myéloïdes. Les colorants ROS mitochondriaux sont très réactifs et des étapes de lavage appropriées sont nécessaires pour s’assurer que tout excès de colorant a été enlevé avant de commencer les étapes suivantes.
Il existe plusieurs colorants fluorogènes ROS chimiquement distincts qui peuvent être utilisés dans ce protocole, pour atteindre un peu de connaissance du statut redux dans les cellules hématopoïétiques vivantes. Cette technique a été largement utilisée dans la littérature, et peut fournir des aperçus utiles sur les voies métaboliques et de signalisation qui sont différemment régulées dans les cellules leucémiques, si on les compare à leurs homologues normaux.
