Реактивные виды кислорода или ROS, являются высокореактивными видами кислорода, которые производятся клетками, и влияет на их поведение. Хотя избыток ROS также может вызвать широко распространенный клеточный хаос, а в тяжелых случаях, гибель клеток. Таким образом, поддержание РОС гомеостаза имеет основополагающее значение для клеточной функции и выживания.
Протокол, представленный здесь, фокусируется на измерении определенного типа ROS, который генерируется митохондриями, главным образом как метаболический побочный продукт в живых, нормальных или здоровых гематопоэтических стволовых и прародителя клеточных популяций, а также в клетках лейкемии из мышиной модели рака крови, острого миелоидного лейкоза или АМЛ. Этот протокол также может быть использован для оценки того, как генетические манипуляции, такие как удаление генов или переэкспрессия, влияют на митохондриальные ROS в нескольких здоровых и злокачественных гематопоэтических популяциях. И в результате, потенциально обеспечивают проницательную информацию о состоянии redux и, возможно, метаболизм клеток.
Этот метод разрешает поток урегулировать метрический анализ протогенного зонда для мониторинга митохондриального производства ROS в живых здоровых и злокачественных гематопоэтических стволовых и прародителя субпопеи. Этот протокол прост и может быть завершен в течение нескольких часов. Кроме того, он подходит для анализа живых клеток и позволяет различать и анализировать митохондриальные ROS в популяции стволовых клеток в костном мозге, используя поверхностный знак окрашивания.
После сбора моноядерных клеток костного мозга от диких туго мышей и лейкемии MLL-AF9 мышей, в соответствии с рукописью, aliquot 200 микролитров клеточной подвески в каждом из девяти одноцветных труб управления. Aliquot оставшихся клеток в другие экспериментальные трубки, 200 микролитров каждый. Затем поместите в центрифугу две экспериментальные трубки, содержащие клетки костного мозга и лейкемические клетки соответственно, и одну контрольную трубку.
Центрифуга при 300 раз G в течение пяти минут. Далее, декант supernatant, и повторно приостановить клетки в комнатной температуре F-PBS с живой / мертвой ячейки пятна, в соответствии с инструкциями производителя. Инкубировать на льду в течение 30 минут.
После этого добавьте 1 миллилитр комнатной температуры F-PBS к трем живым/мертвым окрашенным трубам и одну трубку управления цветом для окрашивания митохондриального красителя ROS. Поместите трубки в центрифугу при температуре 300 Г в течение пяти минут при комнатной температуре. Затем получите 5 миллимолярный митохондриальный раствор красителя ROS, повторно приостановив 50 микрограмм митохондриального красителя ROS в 13 микролитров DMSO.
Затем добавьте 13 миллилитров комнатной температуры F-PBS к 13 микролитровому митохондриальному красителю ROS, чтобы разбавить до конечной концентрации пять микромолеров. При необходимости добавьте 13 микролитров 50 миллимоляров Verapamil в раствор для ингибирования митохондриальных насосов эффлюкса. Получить трубки из центрифуги и аспирировать от мытья живых / мертвых клеток пятна.
Добавить 200 микролитров F-PBS в живых / мертвых окрашивания контроля и держать его во льду, пока не готовы начать анализ. Добавьте 200 микролитров митохондриального пятна красителя ROS, содержащего Verapamil, в каждую экспериментальную трубку, а также митохондриальную трубку управления окрашивания ROS. Вихрь смешивать и инкубировать в течение 10 минут при 37 градусах по Цельсию в темноте.
Затем добавьте 1 миллилитр комнатной температуры F-PBS в контрольные и экспериментальные трубки. Центрифуга пять минут при температуре в 300 Г при комнатной температуре. Аспирировать от супернатента и мыть клетки с дополнительным один миллилитр комнатной температуры F-PBS.
Центрифуга снова в течение пяти минут при 300 раз G, при комнатной температуре. Во-первых, подготовить два антитела коктейли для здоровых и лейкозных клеток костного мозга. Аспирировать супернатант из экспериментальной трубки, содержащей здоровые клетки костного мозга, и добавить 200 микролитров антител коктейль номер один в трубку.
Вихрь смешивать. Также подготовьте одиночные пробки управления цвета путем добавлять 200 микролитров F-PBS и одного microliter соединого антитела. Инкубировать в течение 60 минут на льду в темноте.
Аспирировать супернатант из экспериментальной трубки, содержащей лейкемию костного мозга, и добавить 200 микролитров антител коктейль номер два, в трубку. Вихрь смешивать. Инкубировать в течение 60 минут на льду в темноте.
После этого, мыть все трубки с 1 миллилитр холодной F-PBS и центрифуги в течение пяти минут при 300 раз G при комнатной температуре. Повторно приостанавливать клетки в 500 микролитров холодного F-PBS. Перенесите подвеску клетки в каждую цитометровую трубку потока с 40-метровым фильтром для исключения агрегатов.
Во-первых, вставьте один не пятно управления трубкой в поток цитометрии машины и начать приобретение, чтобы компенсировать поток цитометрии машины. Повторите для других контрольных труб. После этого прочитайте экспериментальные трубки, чтобы установить ворота.
Для анализа размера и сложности популяции клеток, в первую очередь для здорового HSPC, установите передовую площадь рассеяния и боковые участки рассеяния популяций. Нажмите кнопку Квадратные ворота, чтобы ворота из посторонних мусора с вперед и сбоку рассеяния участка. Затем, на вперед рассеяния области и высоты участка, использовать двойной дискриминатор ворот из дублетов.
Выберите живые клетки, линии низких клеток, и различные здоровые HSPC. Для каждой группы интересов проанализируйте медианную интенсивность флуоресценции канала TRPE в сюжете гистаграммы, чтобы оценить различия в митохондриальном сигнале ROS. Повторите ту же процедуру анализа размера, gating и гистограммы заговора для популяций лейкемии.
Клетки костного мозга, изолированные от здоровых мышей, были окрашены живым/мертвым красителем и митохондриальным красителем ROS, а затем окрашены антителами, распознавающих маркеры линии: плюс CD48, C-комплект, Sca-1, CD34 и CD150. Кроме того, клетки костного мозга у мышей лейкемии также были окрашены CD45.2 для различего клеток лейкемии MLL-AF9 от здоровых клеток костного мозга реципиента, окрашенных CD45.1. Сравнение митохондриального окрашивания ROS, между здоровым CD48 отрицательным LSK, и миелоидных прародителей, показывает, что миелоидные прародители отображают значительно более высокие уровни митохондриального окрашивания ROS.
Кроме того, c-Kit высокой лейкемии прародителей дисплей значительно более высокие уровни митохондриального окрашивания ROS, по сравнению с c-Kit промежуточных низких клеток лейкемии, здоровый CD48 отрицательных LSK и миелоидных прародителей. C-Kit промежуточных низких клеток лейкемии, также отображается значительно более высокое значение по сравнению с CD48 отрицательных клеток LSK, но не миелоидных прародителей. Митохондриальные красители ROS являются высокореактивными и соответствующие шаги мытья необходимы для обеспечения того, чтобы любое избыток красителя был удален до начала следующих шагов.
Есть несколько химически различных ROS фторгенных красителей, которые могут быть использованы в этом протоколе, для достижения немного знаний о статусе redux в живых гематопоэтических клеток. Этот метод широко используется в литературе, и может обеспечить полезную информацию о метаболических и сигнальных путей, которые дифференцированно регулируется в клетках лейкемии, по сравнению с их нормальными коллегами.
