我们的协议描述了一个简单的体外系统，用于研究分离分子对碳酸钙的形态和结构的影响。在生物分子 I 测试价格昂贵或数量少的情况下，以及需要缓慢的碳酸钙沉淀的情况下，这种技术是有利的。此外，它允许在相同的条件下同时探测多个降水实验。
首先，准备控制实验。使用三蒸馏水和乙醇清洁玻璃碎片和玻璃器皿。使用钻石笔切割玻璃显微镜幻灯片的碎片，以便它们适合 96 井板的井。
将玻璃杯放在烧杯中，加三蒸馏水，使水覆盖玻璃滑梯。在沐浴声波器中声波 10 分钟。把水去。
加入乙醇覆盖玻璃滑梯，并在沐浴声波器中再次声波10分钟。然后，用氮气流干燥滑梯和玻璃器皿，并在空气等离子清洁剂中放置 10 分钟，功率为 130 瓦。在烟气罩中，用碳酸铵粉末填充96孔板角的油井，并使用铝箔密封板。
用石蜡膜盖住铝箔。使用氮气清洁任何残留的碳酸铵。将先前切割和清洁的玻璃碎片放入离中心最近的五个不同的孔中。
每一个带有玻璃片的玻璃填充 100 微升氯化钙溶液，用三蒸馏水制成，梯度增加 10、20、30、40 和 50 毫摩尔。接下来，用针头刺穿每个含有碳酸铵的井盖三次。将盖子放回去，用石蜡薄膜密封边界，并在孵化器中保持18摄氏度20小时。
在孵育过程中，碳酸铵分解成氨和二氧化碳，扩散成氯化钙溶液，形成碳酸钙晶体。孵育后，小心地打开烟罩内的盖子，并使用循环去除水空气界面上形成的晶体。使用钳子将玻璃碎片转移到装有双蒸馏水的烧杯中，进行短浸。
然后，从烧杯中取出样品，并使用双面胶带将玻璃片固定到培养皿的底部。用纸巾擦拭接触滑梯边框的干水。盖住培养皿，并放在干燥器中 24 小时。
使用直立光学显微镜观察玻璃片上形成的晶体，放大倍数为 10 到 40 倍。观察到的菱形晶体很可能是钙化物。如果除了菱形晶体外，溶液中还含有最有可能的圆石球形晶体，请重复结晶协议，确保正确执行清洁步骤。
此外，确保除专用井以外的板区没有碳酸铵。氯化钙的最佳浓度是根据富含光滑面的钙化物晶体的样品确定的，没有瓦塔石晶体。首先，清洁玻璃滑梯和玻璃器皿，如前所述。
在烟气罩中，将碳酸铵粉末放在 96 井板的角落。在每个发生降水的井中，放置一块被切割和清洁的玻璃片。准备控制井。
进入两口控制井，移液器90微升25毫摩尔三酯缓冲液在pH8，辅以100毫摩尔氯化钠。然后加入10微升0.5摩尔氯化钙库存溶液。然后，在pH8下将添加剂蛋白TapA的浓度调整为10微摩尔TapA、100毫摩尔氯化钠和25毫摩尔三酯缓冲液。
通过添加 90 微升添加剂溶液来准备含添加剂井。在含有含浓度的孔中加入10微升0.5摩尔氯化钙库存溶液，以达到先前确定的50毫摩尔氯化钙的最佳浓度。在含有碳酸铵的井盖上用孔准备板，并像以前一样在 18 摄氏度下孵育。
孵育后，像之前一样在培养皿中准备玻璃片，将盘子放在干燥器中24小时。要量化碳酸钙沉淀物中添加剂的质量百分比，首先验证所用添加剂的消光系数。然后，使用微平衡来称量晶体形成的玻璃碎片。
之后，用1.2毫升0.1摩尔醋酸溶液将玻璃的晶体刮入eppe管中。漩涡短暂，然后将管子放入声波器中，使样品声波化，直到晶体消失。样品在室温下储存24小时。
刮掉晶体后，称量玻璃滑梯。测量蛋白质添加剂的 1.2 毫升声波溶液的紫外线吸光度 A。使用啤酒-兰伯特方程计算其浓度 c。
L 是 cuvette 内的光路。要计算晶体中添加剂的质量，请使用等式，c 倍 v 等于 m，如果浓度以每毫升毫克为单位。如果浓度以摩尔/升为单位，则计算应用 c 倍 v 等于 n 的摩尔。
然后使用分子量计算添加剂的质量。计算晶体中添加剂的重量百分比。M 是添加剂的质量，增量 m s 是从玻璃片上刮下来的碳酸钙晶体的质量。
SEM 图像显示了具有平滑方方的合适控件与由步骤组成的面的方解石晶体之间的比较。球形晶体是瓦多石。成功且不成功的对照实验产生了拉曼光谱，分别显示了钙化物和瓦特罗石的典型光谱。
拉曼移位在1080厘米左右的分裂是瓦石最明显的特征。碳酸钙的晶体在Tata的存在下形成，与控制晶体不同。形成了一个由多个钙化物微晶组成的复杂的球面碳酸钙总成。
在Tata存在的情况下形成的晶体的拉曼光谱与方解石光谱相似。TapA 的吸水光谱和不含添加剂的控制在酸中晶体溶解后进行测量。TapA 的质量百分比被确定为 1.8 正负 0.2% 关键，在测试添加剂对碳酸钙形成的影响之前，必须遵循清洁步骤，并确保达到控制标准。
此外，从井中去除粉末状的碳酸铵含量为重要。碳酸铵分解成氨和二氧化碳。如果吸入氨是有毒的，因此碳酸铵只应在烟罩内处理。
为了评估晶体的内部形态和结构，您可以使用聚焦离子束对其进行剖分，用透射电子显微镜对部分进行图像，并测量各部分沿线特定位置的电子衍射模式。该技术以前曾用于研究各种分子对碳酸钙的形态和结构的影响。我们详细阐述了这种生物聚合物的方法，这种聚合物是由生物膜中的细菌细胞产生的。
这将是有趣的进行额外的研究与不同的细菌菌株产生的其他生物聚合物。
