Protokolümüz, izole moleküllerin kalsiyum karbonatın morfolojisi ve yapısı üzerindeki etkisini incelemek için basit bir in vitro sistemi tanımlar. Bu teknik, test ettiğim biyomoleküllerin pahalı olduğu veya küçük miktarlarda mevcut olduğu ve yavaş kalsiyum karbonat çökeltisi gerektirdiği durumlarda avantajlıdır. Ayrıca, aynı anda aynı koşullar altında birden fazla yağış deneyleri araştırmak için izin verir.
İlk olarak, kontrol deneyi hazırlayın. Cam parçaları ve cam temizlemek için üçlü distile su ve etanol kullanın. Bir cam mikroskop slayt parçaları kesmek için bir elmas kalem kullanın, böylece bir 96-well plaka bir kuyu sığacak.
Üç adet distile su ile bir beher cam yerler yerleştirin, böylece su cam slaytlar kapsar. 10 dakika boyunca bir banyo sonicator sonicate. Suyu decant.
Cam slaytlar kapsayacak şekilde etanol ekleyin ve 10 dakika boyunca bir banyo sonicator tekrar sonicate. Daha sonra, azot gazı akışı ile slaytlar ve cam kuru ve 130 watt 10 dakika boyunca bir hava plazma temizleyici yerleştirin. Bir duman kaputunda, amonyum karbonat tozu ile 96 kuyulu bir plaka köşelerinde kuyudoldurun ve alüminyum folyo kullanarak plaka mühür.
Folyoyu parafin filmle kaplayın. Azot gazı kullanarak kalan amonyum karbonatı temizleyin. Önceden kesilmiş ve temizlenmiş cam parçalarını merkeze en yakın beş farklı kuyuya yerleştirin.
10, 20, 30, 40 ve 50 milimolar konsantrasyonlarda artan bir degrade üç distile su ile hazırlanan kalsiyum klorür çözeltisi 100 mikrolitre ile hazırlanan her kuyu taşıyan bir cam parça doldurun. Daha sonra, amonyum karbonat içeren kuyuların her birinin kapağını bir iğne ile üç kez delin. Kapağı arkaya koy, sınırları parafin filmle kapat ve 20 saat boyunca kuvözde 18 derecede tut.
Kuluçka sırasında amonyum karbonat amonya ve karbondioksite ayrıştırılır ve kalsiyum klorür çözeltilerine yayılır ve kalsiyum karbonat kristallerinin oluşumuna neden olarak ortaya konur. Kuluçkadan sonra, bir duman kaputunun içindeki kapağı dikkatlice açın ve su-hava arabiriminde oluşan kristalleri çıkarmak için bir döngü kullanın. Kısa bir dalış için çift distile su içeren bir beher içine cam parçaları aktarmak için cımbız kullanın.
Daha sonra, kabın örneklerini çıkarın ve petri kabının dibine cam parçaları düzeltmek için çift taraflı bant kullanın. Kuru aşırı su doku mendilleri ile, slayt sınırlarına dokunarak. Petri kabının üzerini kapatın ve 24 saat boyunca kurutucuya koyun.
10 ila 40 kat büyütme dik optik mikroskop ile cam parçaları üzerinde oluşan kristalleri gözlemleyin. Gözlenen rhombohedral kristaller büyük olasılıkla kalsit vardır. Rhombohedral kristallere ek olarak, çözelti büyük olasılıkla vaterite olan küresel kristaller içeriyorsa, temizleme adımının doğru yapıldığından emin olmak için kristalizasyon protokolünü tekrarlayın.
Ayrıca, plaka nın özel kuyular dışında herhangi bir amonyum karbonat olmadığından emin olun. Kalsiyum klorür için en uygun konsantrasyon, vaterite kristalleri içermeyen pürüzsüz yönlü kalsit kristalleri ile zengin numuneye göre belirlenir. Başlamak için, temiz cam slaytlar ve cam daha önce yapıldığı gibi.
Bir duman kaputunda, 96 kuyulu bir plakanın köşelerinde amonyum karbonat tozu yerleştirin. Yağışın meydana gelecek her kuyuya, kesilmiş ve temizlenmiş bir cam parça yerleştirin. Kontrol kuyularını hazırlayın.
Iki kontrol kuyuları içine, pipet 90 mikrolitre 25 milimolar Tris tampon pH 8, 100 milimoler sodyum klorür ile desteklenmektedir. Sonra 0,5 molar kalsiyum klorür stok çözeltisi 10 mikrolitre ekleyin. Daha sonra, katkı proteini TapA konsantrasyonu ayarlamak 10 mikromolar TapA, 100 milimolar sodyum klorür, ve 25 milimolar Tris tampon pH 8.
Katkı çözeltisi 90 mikrolitre ekleyerek kuyuiçeren katkı maddesini hazırlayın. Daha önce belirlenen 50 milimolar kalsiyum klorür en uygun konsantrasyona ulaşmak için kuyuiçeren katkı maddesi için 0,5 molar kalsiyum klorür stok çözeltisi 10 mikrolitre ekleyin. Amonyum karbonat içeren kuyuların üzerinde kapakta delikler olan plakayı hazırlayın ve daha önce yapıldığı gibi 18 derecede kuluçkaya yatırın.
Kuluçkadan sonra, cam parçaları daha önce olduğu gibi petri kabına hazırlayın ve kabı 24 saat boyunca kurutucuya yerleştirin. Kalsiyum karbonat çökeltilerinde katkı maddelerinin kütle yüzdesini ölçmek için, öncelikle kullanılan katkı maddesinin yok olma katsayısını doğrulayın. Daha sonra, kristallerin oluştuğu cam parçalarını tartmak için bir mikro denge kullanın.
Bundan sonra, 0,1 molar asetik asit çözeltisi 1.2 mililitre ile bir eppe tüp içine cam kristalleri kazıyın. Girdap kısa bir süre, ve sonra kristaller kaybolana kadar örnek sonicate için bir sonicator içine tüp yerleştirin. Numuneyi oda sıcaklığında 24 saat saklayın.
Kristalleri kazıdıktan sonra cam kaydırağı tartın. Protein katkısı için 280 nanometrede 1,2 mililitresonicated çözeltisinin UV emici A'sını ölçün. C konsantrasyonunu hesaplamak için Bira-Lambert denklemini kullanın.
L, cuvette'nin içindeki optik yoldur. Kristaldeki katkı maddelerinin kütlesini hesaplamak için, konsantrasyon mililitre başına miligram ise, c kez v m eşittir denklemini kullanın. Konsantrasyon litre başına benlerde ise, c kez v uygulayan benleri hesaplayın n eşittir.
Sonra katkı maddelerinin kütlesini hesaplamak için moleküler ağırlığı kullanın. Kristallerdeki katkı maddelerinin ağırlık yüzdesini hesaplayın. M katkı maddelerinin kütlesidir ve delta m s, cam parçasından kazınmış kalsiyum karbonat kristallerinin kütlesidir.
SEM görüntüleri, düzgün kalsit yüzleri ile uygun bir kontrol ile adımlardan oluşan yüzlere sahip kalsit kristalleri arasındaki karşılaştırmayı gösterir. Küresel kristaller vaterite vardır. Başarılı ve başarısız kontrol deneyleri Raman spektroskopisi ile sonuçlandı ve sırasıyla kalsit ve vaterite'nin tipik spektrumlarını gösterdi.
Raman değişiminin yaklaşık 1080 santimetre olarak bölünmesi vaterite'nin en belirgin özelliğidir. TapA varlığında oluşan kalsiyum karbonat kristalleri, kontrol kristallerinden farklıdır. Çoklu kalsit mikrokristallerinden oluşan karmaşık bir küresel kalsiyum karbonat montajı oluşmuştur.
TapA varlığında oluşan kristallerin Raman spektrumu kalsit tayfı benzer. TapA'nın emici spektrumları ve katkı maddesi olmadan kontrol, asitteki kristallerin çözülmesinden sonra ölçüldü. TapA'nın kütle yüzdesi 1.8 artı veya eksi %0.2 olarak belirlendi Temizlik adımlarını dikkatle takip etmek ve katkı maddelerinin kalsiyum karbonat oluşumu üzerindeki etkisini test etmeden önce kontrol standartlarının karşılanmasını sağlamak çok önemlidir.
Buna ek olarak, toz halindeamonyum karbonat fazlalığı kuyulardan kaldırmak önemlidir. Amonyum karbonat amonya ve karbondioksite dönüşür. Amonya solunduğunda toksiktir ve bu nedenle amonyum karbonat sadece bir duman kaputunun içinde ele alınmalıdır.
Kristallerin iç morfolojisini ve yapısını değerlendirmek için, onları odaklanmış bir iyon ışını kullanarak kesebilir, iletim elektron mikroskobu ile bölümleri görüntüleyebilir ve elektron kırınım desenlerini bölümler boyunca belirli konumlardan ölçebilirsiniz. Bu teknik daha önce çeşitli moleküllerin kalsiyum karbonatın morfolojisi ve yapısı üzerindeki etkisini incelemek için kullanılmıştır. Bu yöntemi, biyofilmlerde bakteri hücreleri tarafından üretilen biyopolimerlere hazırladık.
Farklı bakteriyel suşları tarafından üretilen diğer biyopolimerler ile ek çalışmalar yapmak ilginç olacaktır.
