Nuestro protocolo describe un sistema simple in vitro, para estudiar el efecto de las moléculas aisladas en la morfología y la estructura del carbonato de calcio. Esta técnica es ventajosa en los casos en que las biomoléculas I prueba son costosas, o disponibles en pequeñas cantidades, así como cuando se requiere precipitación lenta de carbonato de calcio. Además, permite sondear múltiples experimentos de precipitación en las mismas condiciones a la vez.
Primero, prepare el experimento de control. Utilice agua triple destilada y etanol para limpiar piezas de vidrio y cristalería. Utilice una pluma de diamante para cortar trozos de un portaobjetos de microscopio de vidrio, de modo que encajen en un pozo de una placa de 96 pozos.
Coloque los lugares de vidrio en un vaso de precipitados con agua destilada triple, de modo que el agua cubra los toboganes de vidrio. Sonicar en un sonicador de baño durante 10 minutos. Decantar el agua.
Agregue etanol para cubrir los portaobjetos de vidrio y sonice de nuevo en un sonicador de baño durante 10 minutos. Luego, seque los portaobjetos y la cristalería con una corriente de gas nitrógeno, y colóquelos en un limpiador de plasma de aire durante 10 minutos a 130 vatios. En una campana de humo, llene los pozos en las esquinas de una placa de 96 pozos con polvo de carbonato de amonio, y selle la placa con papel de aluminio.
Cubra el papel de aluminio con película de parafina. Limpie cualquier carbonato de amonio residual con gas nitrógeno. Coloque las piezas de vidrio previamente cortadas y limpiadas en cinco pozos diferentes más cercanos al centro.
Llene cada pozo con una pieza de vidrio con 100 microlitros de solución de cloruro de calcio preparada con agua triple destilada a un gradiente creciente de 10, 20, 30, 40 y 50 concentraciones miliamperosas. A continuación, perfore la cubierta de cada uno de los pozos que contienen carbonato de amonio tres veces con una aguja. Ponga la tapa hacia atrás, selle los bordes con película de parafina y manténgala a 18 grados centígrados en una incubadora durante 20 horas.
Durante la incubación, el carbonato de amonio se descompone en amoníaco y dióxido de carbono, que se difunden en soluciones de cloruro de calcio, lo que resulta en la formación de cristales de carbonato de calcio. Después de la incubación, abra la tapa cuidadosamente dentro de una campana de humo, y utilice un bucle para eliminar los cristales formados en la interfaz agua-aire. Utilice pinzas para transferir las piezas de vidrio en un vaso de precipitados que contenga agua doble destilada para un chapuzón corto.
A continuación, retire las muestras del vaso de precipitados y use cinta adhesiva de doble cara para fijar las piezas de vidrio en la parte inferior de la placa Petri. Seca el exceso de agua que toca los bordes del tobogán, con toallitas de tejido. Cubra el plato de Petri y colóquelo en un desecador durante 24 horas.
Observe los cristales formados en las piezas de vidrio con un microscopio óptico vertical de 10 a 40 veces el aumento. Los cristales rombodral observados son probablemente calcita. Si además de los cristales romboédricos, la solución contiene cristales esféricos que probablemente son vateritas, repita el protocolo de cristalización, asegurándose de que el paso de limpieza se realiza correctamente.
Además, asegúrese de que no haya carbonato de amonio en áreas de la placa que no sean los pozos dedicados. La concentración óptima para el cloruro de calcio se determina de acuerdo con la muestra rica en cristales de calcita facetadas lisas sin cristales de vaterita. Para empezar, limpie los portaobjetos de vidrio y la cristalería como se ha hecho anteriormente.
En una campana de humo, coloque el polvo de carbonato de amonio en las esquinas de una placa de 96 pozos. En cada pozo donde se producirá la precipitación, coloque una pieza de vidrio que fue cortada y limpiada. Preparen los pozos de control.
En dos pozos de control, pipeta 90 microlitros de 25 mililitros Tris tampón a pH 8, complementado con 100 cloruro de sodio mililolar. A continuación, añada 10 microlitros de solución de 0,5 molares de cloruro de calcio. A continuación, ajuste la concentración de proteína aditiva TapA a 10 TapA micromolar, 100 cloruro de sodio mili evolucionado y 25 tampón Tris mililolares a pH 8.
Preparar el aditivo que contiene los pozos añadiendo 90 microlitros de la solución aditiva. Añadir 10 microlitros de solución de 0,5 molar de cloruro de calcio al aditivo que contiene los pozos para alcanzar la concentración óptima a 50 cloruros de calcio mililosos determinados previamente. Preparar la placa con agujeros en la cubierta sobre los pozos que contienen carbonato de amonio, e incubar a 18 grados Centígrados como se hacía anteriormente.
Después de la incubación, preparar las piezas de vidrio en un plato de Petri como se hizo antes, y colocar el plato en un desecador durante 24 horas. Para cuantificar el porcentaje de masa de los aditivos en los precipitados de carbonato de calcio, primero verifique el coeficiente de extinción del aditivo utilizado. Luego, usa un microbalance para pesar las piezas de vidrio donde se formaron los cristales.
Después de eso, raspa los cristales del vidrio en un tubo eppe con 1,2 mililitros de solución de ácido acético molar 0.1. Vórtice brevemente, y luego coloque el tubo en un sonicador para sonicar la muestra hasta que los cristales desaparezcan. Conservar la muestra a temperatura ambiente durante 24 horas.
Pesar el portaobjetos de vidrio después de raspar los cristales. Mida la absorbancia UV A de la solución sonicada de 1,2 mililitros a 280 nanómetros para el aditivo proteico. Utilice la ecuación Beer-Lambert para calcular su concentración c.
L es la trayectoria óptica dentro de la cubeta. Para calcular la masa de los aditivos en el cristal, utilice la ecuación, c por v es igual a m, si la concentración está en miligramos por mililitro. Si la concentración está en lunares por litro, calcule los lunares que se aplican c por v es igual a n.
A continuación, utilice el peso molecular para calcular la masa de los aditivos. Calcular el porcentaje de peso de los aditivos en los cristales. M es la masa de los aditivos, y delta m s, es la masa de los cristales de carbonato de calcio que fueron raspados de la pieza de vidrio.
Las imágenes SEM muestran la comparación entre un control adecuado con caras de calcita lisas, y cristales de calcita con caras compuestas de escalones. Los cristales esféricos son vaterita. Los experimentos de control exitosos e infructuosos dieron lugar a la espectroscopia Raman, mostrando los espectros típicos de calcita y vaterita respectivamente.
La división del desplazamiento de Raman alrededor de 1080 por centímetro es la característica más evidente de la vaterita. Los cristales de carbonato de calcio formados en presencia de TapA, son distintos de los cristales de control. Se formó un complejo conjunto de carbonato de calcio esférico, compuesto por múltiples microcristales de calcita.
El espectro Raman de los cristales formados en presencia de TapA, es similar al espectro de calcita. Los espectros absorbentes de TapA, y el control sin el aditivo, se midieron después de la disolución de los cristales en ácido. El porcentaje de masa de TapA se determinó que es 1.8 más o menos 0.2%Es fundamental seguir los pasos de limpieza cuidadosamente, y para asegurarse de que se cumplen los estándares de control antes de probar el efecto de los aditivos en la formación de carbonato de calcio.
Además, es importante eliminar cualquier exceso de carbonato de amonio en forma de polvo de los pozos. El carbonato de amonio se descompone en amoníaco y dióxido de carbono. El amoníaco es tóxico si se inhala y, por lo tanto, el carbonato de amonio debe manipularse únicamente dentro de una campana de humo.
Para evaluar la morfología interna y la estructura de los cristales, puede secarlos usando un haz de iones enfocado, tomar imágenes de las secciones con un microscopio electrónico de transmisión y medir los patrones de la difracción de electrones desde ubicaciones específicas a lo largo de las secciones. Esta técnica se ha utilizado previamente para estudiar el efecto de varias moléculas en la morfología y estructura del carbonato de calcio. Hemos elaborado este método para biopolímeros que son producidos por células bacterianas en biopelículas.
Será interesante realizar estudios adicionales con otros biopolímeros producidos por diferentes cepas bacterianas.
