הפרוטוקול שלנו מתאר מערכת במבחנה פשוטה, כדי לחקור את ההשפעה של מולקולות מבודדות על המורפולוגיה והמבנה של סידן פחמתי. טכניקה זו היא יתרון במקרים שבהם biomolecules אני בודק הם יקרים, או זמין בכמויות קטנות, כמו גם כאשר משקעים סידן פחמתי איטי נדרש. יתר על כן, זה מאפשר לחקור ניסויים משקעים מרובים באותם תנאים בבת אחת.
ראשית, הכינו את ניסוי הבקרה. השתמש במים מזוקקים משולשים ואתנול כדי לנקות חתיכות זכוכית וכלי זכוכית. השתמש בעט יהלום כדי לחתוך חתיכות של מגלשת מיקרוסקופ זכוכית, כך שהם מתאימים באר של צלחת 96 היטב.
מניחים את מקומות הזכוכית ב עם מים מזוקקים משולשים, כך שהמים מכסים את מגלשות הזכוכית. סוניקאט ב sonicator אמבטיה במשך 10 דקות. תדק את המים.
מוסיפים אתנול כדי לכסות את מגלשות הזכוכית, ו sonicate שוב sonicator אמבטיה במשך 10 דקות. לאחר מכן, לייבש את המגלשות ואת כלי הזכוכית עם זרם של גז חנקן, ולמקום אותם מנקה פלזמה אוויר במשך 10 דקות ב 130 וואט. במכסה המנוע של האדים, ממלאים את בארות בפינות של צלחת 96 באר עם אבקת אמוניום קרבונט, ולאטום את הצלחת באמצעות רדיד אלומיניום.
כסו את נייר הכסף בסרט פרפין. נקה כל שאריות אמוניום קרבונט באמצעות גז חנקן. מניחים את חתיכות הזכוכית שנחתכה ונוקתה בעבר לחמש בארות שונות הקרובות ביותר למרכז.
מלאו כל באר הנושאת חתיכת זכוכית ב-100 מיקרוליטרים של תווי סידן כלורי המוכנים במים מזוקקים משולשים בריכוז הולך וגדל של 10, 20, 30, 40 ו-50 מילימולרים. לאחר מכן, לנקב את הכיסוי של כל בארות המכיל אמוניום קרבונט שלוש פעמים עם מחט. שים את המכסה בחזרה, לאטום את הגבולות עם סרט פרפין, ולשמור אותו ב 18 מעלות צלזיוס באינקובטור במשך 20 שעות.
במהלך הדגירה, אמוניום פחמתי מפורק לתוך אמוניה ופחמן דו חמצני, אשר להתפזר לתוך פתרונות סידן כלורי, וכתוצאה מכך היווצרות גבישי סידן פחמתי. לאחר הדגירה, פתח את המכסה בזהירות בתוך מכסה המנוע של האדים, ולהשתמש בלולאה כדי להסיר את הגבישים שנוצרו בממשק אוויר המים. השתמש פינצטה כדי להעביר את חתיכות הזכוכית לתוך המכילה מים מזוקקים כפולים לטבילה קצרה.
לאחר מכן, להסיר את הדגימות מן המקור, ולהשתמש קלטת דו צדדית כדי לתקן את חתיכות הזכוכית על החלק התחתון של צלחת פטרי. מים מוגזמים יבשים נוגעים בגבולות המגלשה, עם מגבוני רקמות. מכסים את צלחת פטרי, וממקמים אותה בדשן במשך 24 שעות.
שימו לב לקריסטלים שנוצרו על חתיכות הזכוכית עם מיקרוסקופ אופטי זקוף בהגדלה של פי 10 עד 40. גבישי הרומבוהדרל הנצפים הם ככל הנראה קלציט. אם בנוסף גבישי rhombohedral, הפתרון מכיל גבישים כדוריים אשר ככל הנראה vaterite, לחזור על פרוטוקול התגבשות, לוודא כי שלב הניקוי מבוצע כראוי.
יתר על כן, ודא שאין אמוניום קרבונט באזורים של הצלחת מלבד בארות ייעודיות. הריכוז האופטימלי של סידן כלורי נקבע על פי המדגם עשיר בגבישי קלציט חלקים ללא גבישי ואגריט. כדי להתחיל, שקופיות זכוכית נקיות וכלי זכוכית כפי שנעשה בעבר.
במכסה המנוע של האדים, מניחים אבקת אמוניום קרבונט בפינות של צלחת 96 באר. בכל באר שבה יתרחשו משקעים, מניחים חתיכת זכוכית שנחתכה ונוקתה. הכינו את בארות הבקרה.
לשתי בארות בקרה, פיפטה 90 מיקרוליטר של חיץ טריס 25 מילימולר ב pH 8, בתוספת 100 מילימולר נתרן כלורי. לאחר מכן הוסיפו 10 מיקרוליטרים של תספורת מלאי סידן כלורי טוחן 0.5. לאחר מכן, להתאים את הריכוז של חלבון תוסף TapA ל 10 micromolar TapA, 100 מילימולר נתרן כלורי, ו 25 מילימולר טריס חוצץ ב pH 8.
הכן את התוסף המכיל בארות על ידי הוספת 90 מיקרוליטרים של פתרון התוסף. הוסף 10 microliters של 0.5 תספורת מלאי סידן כלוריד טוחן לתוסף המכיל בארות כדי להגיע לריכוז אופטימלי ב 50 מילימולר סידן כלורי שנקבע בעבר. מכינים את הצלחת עם חורים על המכסה על בארות המכילות אמוניום קרבונט, ודגירה ב 18 מעלות צלזיוס כפי שנעשה בעבר.
לאחר הדגירה, מכינים את חתיכות הזכוכית בצלחת פטרי כפי שנעשה בעבר, וממקמים את המנה בדשן במשך 24 שעות. כדי לכמת את אחוז המסה של התוספים במשקעי הסידן פחמתי, תחילה לאמת את מקדם ההכחדה של התוסף בשימוש. לאחר מכן, השתמש במיקרו-איזון כדי לשקול את חתיכות הזכוכית שבהן נוצרו הגבישים.
לאחר מכן, לגרד את הגבישים מהזכוכית לתוך צינור eppe עם 1.2 מיליליטר של 0.1 תוסף חומצה אצטית טוחנת. מערבולת בקצרה, ולאחר מכן למקם את הצינור לתוך sonicator כדי sonicate המדגם עד הגבישים נעלמים. לאחסן את המדגם בטמפרטורת החדר במשך 24 שעות.
לשקול את מגלשת הזכוכית לאחר גירוד את הגבישים. למדוד את ספיגת UV A של 1.2 מיליליטר sonicated פתרון ב 280 ננומטר עבור תוסף החלבון. השתמש במשוואה באר למברט כדי לחשב את הריכוז שלה c.
L הוא הנתיב האופטי בתוך המזנון. כדי לחשב את המסה של התוספים בגביש, השתמש במשוואה, c times v שווה ל- m, אם הריכוז הוא במיליגרם למיליליטר. אם הריכוז הוא שומות לליטר, ואז לחשב את שומות החלת c פעמים v שווה n.
לאחר מכן השתמש במשקל המולקולרי כדי לחשב את המסה של התוספים. לחשב את אחוז המשקל של התוספים בגבישים. M הוא המסה של התוספים, ודלתא m s, היא המסה של גבישי סידן פחמתי כי היו גירדו את חתיכת הזכוכית.
תמונות SEM מציגות את ההשוואה בין פקד תקין עם פרצופי קלציט חלקים, לבין גבישי קלציט עם פנים המורכבות ממדרגות. הגבישים הכדוריים הם ואגריט. ניסויי הבקרה המוצלחים והבלתי מוצלחים גרמו לספקטרוסקופיה של אמן, והראו את הספקטרום האופייני של קלציט ו-ואטרייט בהתאמה.
הפיצול של משמרת ראמאן בסביבות 1080 ס"מ הוא המאפיין הבולט ביותר של ואטרייט. גבישי הסידן פחמתי שנוצרו בנוכחות TapA, נבדלים מקריסטלי הבקרה. הרכבה כדורית מורכבת של סידן פחמתי, המורכבת ממיקרו-קריסטלים קלציט מרובים נוצרה.
ספקטרום הראמאן של הגבישים שנוצרו בנוכחות TapA, דומה לספקטרום הקלציט. הספקטרום הסופג של TapA, והשליטה ללא התוסף, נמדדו לאחר פירוק הגבישים בחומצה. אחוז המסה של TapA נקבע להיות 1.8 פלוס או מינוס 0.2%, זה קריטי כדי לבצע את צעדי הניקוי בזהירות, ולוודא כי תקני הבקרה הם נפגשו לפני בדיקת ההשפעה של תוספים על היווצרות סידן פחמתי.
בנוסף, חשוב להסיר כל עודף של אמוניום קרבונט בצורת אבקת מן בארות. אמוניום פחמתי מתרוקן לאמוניה ופחמן דו חמצני. אמוניה רעילה אם בשאיפה, ולכן, אמוניום קרבונט צריך להיות מטופל בתוך מכסה המנוע אדים בלבד.
על מנת להעריך את המורפולוגיה הפנימית ואת המבנה של הגבישים, אתה יכול לחלק אותם באמצעות קרן יון ממוקדת, תמונה החלקים עם מיקרוסקופ אלקטרונים שידור, ולמדוד את דפוסי דיפוזיה אלקטרונים ממיקומים ספציפיים לאורך הקטעים. טכניקה זו שימשה בעבר לחקר ההשפעה של מולקולות שונות על המורפולוגיה והמבנה של סידן פחמתי. פירטנו שיטה זו כדי biopolymers המיוצרים על ידי תאים חיידקיים ביופילמים.
זה יהיה מעניין לבצע מחקרים נוספים עם ביופולימרים אחרים המיוצרים על ידי זנים חיידקיים שונים.
