우리의 프로토콜은 탄산칼슘의 형태와 구조에 고립 된 분자의 효과를 연구하기 위해 간단한 체외 시스템을 설명합니다. 이 기술은 내가 시험하는 생체 분자가 비싸거나 소량으로 제공될 뿐만 아니라 탄산칼슘 강수량이 느린 경우에도 유리합니다. 또한 동일한 조건에서 한 번에 여러 강수량 실험을 프로브할 수 있습니다.
먼저 제어 실험을 준비합니다. 3배의 증류수와 에탄올을 사용하여 유리 조각과 유리 제품을 청소하십시오. 다이아몬드 펜을 사용하여 유리 현미경 슬라이드조각을 잘라96웰 플레이트에 잘 맞습니다.
유리를 세 번 의 증류수가 있는 비커에 놓아 물이 유리 슬라이드를 덮습니다. 목욕 초음파 처리기에서 10 분 동안 초음파 처리하십시오. 물을 데산합니다.
에탄올을 추가하여 유리 슬라이드를 덮고 목욕 초음파 처리기로 10 분 동안 다시 초음파 처리합니다. 그런 다음 슬라이드와 유리 제품을 질소 가스 스트림으로 건조시키고 130 와트로 10 분 동안 공기 플라즈마 클리너에 놓습니다. 연기 후드에, 암모늄 탄산 분말96 잘 접시의 모서리에 우물을 채우고, 알루미늄 호일을 사용하여 접시를 밀봉.
파라핀 필름으로 호일을 덮습니다. 질소 가스를 사용하여 잔류 암모늄 탄산염을 청소하십시오. 이전에 잘라내고 청소한 유리 조각을 중앙에 가장 가까운 5개의 다른 우물에 놓습니다.
10, 20, 30, 40 및 50 밀리머 농도의 증가 그라데이션에서 삼중 증류수로 제조 된 칼슘 염화칼슘 용액 100 마이크로 리터와 유리 조각을 베어링 각 잘 채웁니다. 다음으로, 탄산암모늄을 함유한 각 우물의 커버를 바늘로 세 번 구멍을 뚫는다. 뚜껑을 뒤로 하고 파라핀 필름으로 테두리를 밀봉하고 인큐베이터에서 섭씨 18도에서 20시간 동안 보관하십시오.
인큐베이션 중에 탄산암모늄은 암모니아와 이산화탄소로 분해되어 염화칼슘 용액으로 확산되어 탄산칼슘 결정이 형성됩니다. 인큐베이션 후, 연기 후드 내부에 뚜껑을 조심스럽게 열고 루프를 사용하여 물 공기 인터페이스에서 형성된 결정을 제거합니다. 핀셋을 사용하여 유리 조각을 이중 증류수가 들어 있는 비커로 옮겨 짧은 수영을 하십시오.
그런 다음 비커에서 샘플을 제거하고 양면 테이프를 사용하여 유리 조각을 페트리 접시 의 바닥에 고정시하십시오. 티슈 와이프로 슬라이드의 테두리를 만지는 과도한 물을 건조시하십시오. 페트리 접시를 덮고 24시간 동안 건조기에 놓습니다.
10~40배의 수직 광학 현미경으로 유리 조각상에 형성된 결정을 관찰한다. 관찰 된 진모 결정은 가장 가능성이 방해가됩니다. 마름모꼴 결정 이외에, 용액은 가장 가능성이 바테라이트 인 구형 결정을 포함하는 경우, 결정화 프로토콜을 반복, 청소 단계가 올바르게 수행되도록.
또한 전용 우물 이외의 플레이트 부위에 탄산암모늄이 없는지 확인하십시오. 염화칼슘에 대한 최적의 농도는 바테라이트 결정없이 매끄러운 면주 미수 결정이 풍부한 샘플에 따라 결정됩니다. 시작하려면 유리 슬라이드와 유리 제품을 이전과 같이 청소하십시오.
연기 후드에 96웰 플레이트 모서리에 암모늄 탄산 분말을 놓습니다. 강수량이 발생하는 각 우물에서 잘라서 청소한 유리 조각을 놓습니다. 컨트롤 웰을 준비합니다.
두 개의 제어 우물에, 파이펫 90 25 밀리머 트리 버퍼 pH 8, 100 밀리머 나트륨 염화 나트륨으로 보충. 그런 다음 0.5 개의 어금니 칼슘 염화물 재고 용액의 10 마이크로 리터를 추가하십시오. 이어서, 첨가제 단백질 TapA의 농도를 10 마이크로몰라 TapA, 100 밀리머 나트륨 염화나트륨, 및 pH 8에서 25 밀리머 트리버퍼로 조절한다.
첨가제 용액의 90 마이크로리터를 추가하여 우물을 함유한 첨가제를 준비합니다. 0.5 개의 어금니 칼슘 염화물 재고 용액 10 마이크로 리터를 첨가하여 이전에 결정된 50 밀리마일칼슘 염화칼슘에서 최적의 농도에 도달합니다. 탄산암모늄이 함유된 우물 위에 덮개에 구멍이 있는 플레이트를 준비하고, 이전과 마찬가지로 섭씨 18도에서 배양한다.
인큐베이션 후, 페트리 접시에 유리 조각을 준비하고 24 시간 동안 건조기에 접시를 놓습니다. 탄산칼슘 침전물의 첨가제의 질량 백분율을 정량화하기 위해 먼저 사용되는 첨가제의 소멸 계수를 확인한다. 그런 다음 마이크로 밸런스를 사용하여 결정이 형성된 유리 조각을 계량합니다.
그 후, 0.1 어금니 아세산 용액의 1.2 밀리리터와 에페 튜브에 유리에서 결정을 긁어. 소용돌이를 잠시 간략하게 한 다음 튜브를 초음파 처리기로 배치하여 결정이 사라질 때까지 샘플을 초음파 처리합니다. 샘플을 실온에서 24시간 동안 보관합니다.
크리스탈을 긁은 후 유리 슬라이드의 무게를 측정합니다. 단백질 첨가제를 위해 280 나노미터에서 1.2 밀리리터 초음파 용액의 UV 흡광도 A를 측정합니다. 맥주 램버트 방정식을 사용하여 농도 c를 계산합니다.
L은 큐벳 내부의 광학 경로입니다. 결정에서 첨가제의 질량을 계산하려면, 농도가 밀리리터 당 밀리그램인 경우, 방정식, c 시간 v m과 같을 때 를 사용합니다. 농도가 리터당 두더지인 경우 c 시간 v를 적용하는 두더지 v는 n과 같습니다.
그런 다음 분자량을 사용하여 첨가제의 질량을 계산합니다. 결정의 첨가제의 중량 비율을 계산합니다. M은 첨가제의 질량이며, 델타 ms는, 유리 조각을 긁어 낸 탄산칼슘 결정의 질량이다.
SEM 이미지는 매끄러운 방해가 면과 적절한 제어, 단계로 구성된 얼굴로 구성된 얼굴의 방해 결정 사이의 비교를 보여줍니다. 구형 결정은 바테라이트입니다. 성공적이고 실패한 대조실험은 라만 분광법으로 이어졌고, 각각 방해와 바테라이트의 전형적인 스펙트럼을 보여 주었다.
약 1080센티미터에서 라만 교대의 분할은 바테라이트의 가장 뚜렷한 특징입니다. TapA의 존재에서 형성된 탄산칼슘의 결정은 대조군 결정과 구별됩니다. 여러 방해미 마이크로 결정으로 구성된 복잡한 구형 탄산칼슘 조립체가 형성되었다.
TapA의 존재에서 형성 된 결정의 라만 스펙트럼은 방해의 스펙트럼과 유사합니다. TapA의 흡수 스펙트럼, 첨가제 없이 대조군, 산내 결정의 용해 후 측정되었다. TapA의 질량%는 1.8 플러스 또는 마이너스 0.2%로 결정되었으며, 세척 단계를 신중하게 따르고 탄산칼슘 형성에 대한 첨가제의 효과를 테스트하기 전에 제어 기준이 충족되는지 확인하는 것이 중요합니다.
또한, 우물에서 분말 형태로 탄산 암모늄의 과잉을 제거하는 것이 중요하다. 암모늄 탄산염은 암모니아와 이산화탄소로 분해됩니다. 암모니아는 흡입하는 경우에 유독하고, 그러므로, 암모늄 탄산염은 연기 후드 안쪽에서만 취급되어야 합니다.
결정의 내부 형태와 구조를 평가하기 위해 초점을 맞춘 이온 빔을 사용하여 단면화하고, 전염 전자 현미경으로 섹션을 이미지하고, 섹션을 따라 특정 위치에서 전자 회절의 패턴을 측정할 수 있습니다. 이 기술은 이전에 탄산칼슘의 형태와 구조에 대한 다양한 분자의 효과를 연구하는 데 사용되었습니다. 우리는 생물막에 있는 세균성 세포에 의해 생성되는 생물 중합체에 이 방법을 정교하게 했습니다.
다른 세균균에 의해 생성된 다른 생체 중합체와 추가 연구를 수행하는 것은 흥미로할 것입니다.
