Nosso protocolo descreve um simples sistema in vitro, para estudar o efeito de moléculas isoladas na morfologia e estrutura do carbonato de cálcio. Esta técnica é vantajosa nos casos em que as biomoléculas que eu testam são caras, ou disponíveis em pequenas quantidades, bem como quando a precipitação lenta de carbonato de cálcio é necessária. Além disso, permite sondar múltiplos experimentos de precipitação sob as mesmas condições ao mesmo tempo.
Primeiro, prepare o experimento de controle. Use água tripla destilada e etanol para limpar peças de vidro e vidros. Use uma caneta de diamante para cortar pedaços de um slide de microscópio de vidro, de modo que eles se encaixam em um poço de uma placa de 96 poços.
Coloque os lugares de vidro em um béquer com água tripla destilada, de modo que a água cubra os slides de vidro. Sonicate em um sonicator de banho por 10 minutos. Decante a água.
Adicione etanol para cobrir os slides de vidro, e sonicar novamente em um sônico de banho por 10 minutos. Em seguida, seque as lâminas e os vidros com um fluxo de gás nitrogênio, e coloque-os em um limpador de plasma de ar por 10 minutos a 130 watts. Em um capô de fumaça, encha os poços nas esquinas de uma placa de 96 poços com pó carbonato de amônio, e sele a placa usando papel alumínio.
Cubra a folha com filme de parafina. Limpe qualquer carbonato de amônio residual usando gás nitrogênio. Coloque as peças de vidro previamente cortadas e limpas em cinco poços diferentes mais próximos do centro.
Encha cada poço com uma peça de vidro com 100 microliters de solução de cloreto de cálcio preparada com água tripla destilada a um gradiente crescente de 10, 20, 30, 40 e 50 concentrações milimonas. Em seguida, puna a tampa de cada um dos poços contendo carbonato de amônio três vezes com uma agulha. Coloque a tampa para trás, sele as bordas com filme de parafina, e mantenha-a a 18 graus Celsius em uma incubadora por 20 horas.
Durante a incubação, o carbonato de amônio é decomposto em amônia e dióxido de carbono, que se difundem em soluções de cloreto de cálcio, resultando na formação de cristais carbonato de cálcio. Após a incubação, abra a tampa cuidadosamente dentro de um capô de fumaça e use um laço para remover os cristais formados na interface água-ar. Use pinças para transferir as peças de vidro em um béquer contendo água dupla destilada para um pequeno mergulho.
Em seguida, remova as amostras do béquer e use fita dupla face para fixar as peças de vidro na parte inferior da placa de Petri. Seque água excessiva tocando as bordas do escorregador, com lenços umedecidos. Cubra a placa de Petri, e coloque-a em um desiccador por 24 horas.
Observe os cristais formados nas peças de vidro com um microscópio óptico vertical de 10 a 40 vezes. Os cristais rombedais observados são provavelmente calcita. Se além dos cristais romboedais, a solução contém cristais esféricos que são provavelmente vaterita, repita o protocolo de cristalização, certificando-se de que a etapa de limpeza seja executada corretamente.
Além disso, certifique-se de que não há carbonato de amônio em áreas diferentes dos poços dedicados. A concentração ideal para cloreto de cálcio é determinada de acordo com a amostra rica com cristais de calcita rossados lisos sem cristais de vaterita. Para começar, limpe lâminas de vidro e vidros como feito anteriormente.
Em um capô de fumaça, coloque pó de carbonato de amônio nos cantos de uma placa de 96 poços. Em cada poço onde ocorrerá a precipitação, coloque uma peça de vidro que foi cortada e limpa. Prepare os poços de controle.
Em dois poços de controle, pipeta 90 microliters de 25 mililitros tris tampão no pH 8, suplementado com cloreto de sódio de 100 mililitros. Em seguida, adicione 10 microliters de 0,5 solução de cloreto de cálcio molar. Em seguida, ajuste a concentração de proteína aditiva TapA para 10 micromolar TapA, 100 mililitro de sódio e 25 milimil tris tampão no pH 8.
Prepare o aditivo contendo poços adicionando 90 microliters da solução aditiva. Adicione 10 microliters de 0,5 solução de cloreto de cálcio molar ao aditivo contendo poços para atingir a concentração ideal em cloreto de cálcio de 50 mililitros determinado anteriormente. Prepare a placa com furos na tampa sobre poços contendo carbonato de amônio e incubar a 18 graus Celsius como feito anteriormente.
Após a incubação, prepare as peças de vidro em uma placa de Petri como feito antes, e coloque a placa em uma desiccadora por 24 horas. Para quantificar a porcentagem de massa dos aditivos nos precipitados carbonato de cálcio, verifique primeiro o coeficiente de extinção do aditivo utilizado. Em seguida, use um microequilípmo para pesar as peças de vidro onde os cristais se formaram.
Depois disso, raspe os cristais do vidro em um tubo de eppe com 1,2 mililitros de solução de ácido acético molar de 0,1. Vórtice brevemente, e, em seguida, coloque o tubo em um sonicator para sonicar a amostra até que os cristais desapareçam. Armazene a amostra em temperatura ambiente por 24 horas.
Pese o deslizamento de vidro depois de raspar os cristais. Meça a absorvância UV A da solução sonicada de 1,2 mililitro a 280 nanômetros para o aditivo proteico. Use a equação Beer-Lambert para calcular sua concentração c.
L é o caminho óptico dentro da cuvette. Para calcular a massa dos aditivos no cristal, use a equação, c vezes v é igual a m, se a concentração estiver em miligramas por mililitro. Se a concentração estiver em mols por litro, então calcule as verrugas aplicando c vezes v é igual a n.
Em seguida, use o peso molecular para calcular a massa dos aditivos. Calcule a porcentagem de peso dos aditivos nos cristais. M é a massa dos aditivos, e delta m s, é a massa dos cristais carbonato de cálcio que foram raspados da peça de vidro.
As imagens SEM mostram a comparação entre um controle adequado com rostos calcitas lisos e cristais de calcita com rostos compostos por passos. Os cristais esféricos são vaterite. Os experimentos de controle bem sucedidos e mal sucedidos resultaram em espectroscopia de Raman, mostrando os espectros típicos de calcita e vaterite, respectivamente.
A divisão do turno de Raman em torno de 1080 por centímetro é a característica mais evidente do vaterite. Os cristais de carbonato de cálcio formados na presença de TapA, são distintos dos cristais de controle. Foi formado um complexo conjunto esférico de carbonato de cálcio, composto por múltiplos microcristais de calcita.
O espectro raman dos cristais formados na presença de TapA, é semelhante ao espectro de calcita. Os espectros absorventes de TapA, e o controle sem o aditivo, foram medidos após a dissolução dos cristais em ácido. A média de Dano foi determinada como sendo 1,8 mais ou menos 0,2% É fundamental seguir as etapas de limpeza cuidadosamente, e garantir que os padrões de controle sejam cumpridos antes de testar o efeito dos aditivos na formação de carbonato de cálcio.
Além disso, é importante remover qualquer excesso de carbonato de amônio em pó dos poços. Carbonato de amônio se decompõe em amônia e dióxido de carbono. A amônia é tóxica se inalada e, portanto, o carbonato de amônio deve ser manuseado apenas dentro de um capô de fumaça.
A fim de avaliar a morfologia interna e a estrutura dos cristais, você pode secioná-los usando um feixe de íons focalado, imaginar as seções com um microscópio eletrônico de transmissão e medir os padrões da difração eletrônica de locais específicos ao longo das seções. Esta técnica tem sido usada anteriormente para estudar o efeito de várias moléculas na morfologia e estrutura do carbonato de cálcio. Elaboramos este método para biopolímeros que são produzidos por células bacterianas em biofilmes.
Será interessante realizar estudos adicionais com outros biopolímeros produzidos por diferentes cepas bacterianas.
