Наш протокол описывает простую систему in vitro, чтобы изучить влияние изолированных молекул на морфологию и структуру карбоната кальция. Этот метод выгоден в тех случаях, когда биомолекулы, которые я тестю, стоят дорого или доступны в небольших количествах, а также при медленном осадке карбонатом кальция. Кроме того, он позволяет исследовать несколько экспериментов осадков в одинаковых условиях одновременно.
Во-первых, подготовить контрольный эксперимент. Используйте тройную дистиллированную воду и этанол для очистки стеклянных кусочков и стеклянной посуды. Используйте бриллиантовую ручку, чтобы орезать кусочки стеклянного микроскопа слайд, так что они вписываются в колодец 96-хорошо пластины.
Поместите стеклянные места в стакан с тройной дистиллированной водой, так что вода покрывает стеклянные горки. Sonicate в ванне sonicator в течение 10 минут. Декант воды.
Добавить этанол, чтобы покрыть стеклянные слайды, и sonicate снова в ванне sonicator в течение 10 минут. Затем высушите горки и стеклянную посуду потоком азотного газа и поместите их в очиститель плазмы воздуха на 10 минут при 130 ваттах. В дымовой капот, заполнить скважины по углам 96-хорошо пластины с карбонатом аммония порошок, и печать пластины с использованием алюминиевой фольги.
Обложка фольги с парафиновой пленкой. Очистите любой остаточный карбонат аммония с использованием азотного газа. Поместите ранее разрезанные и очищенные стеклянные кусочки в пять различных скважин, ближайших к центру.
Заполните каждый хорошо подшипник стеклянный кусок с 100 микролитров раствора хлорида кальция, приготовленные с тройной дистиллированной воды при увеличении градиента 10, 20, 30, 40 и 50 миллимолярной концентрации. Затем проколите крышку каждой из скважин, содержащих карбонат аммония три раза иглой. Положите крышку обратно, запечатать границы с парафиновой пленкой, и держать его на 18 градусов по Цельсию в инкубаторе в течение 20 часов.
Во время инкубации карбонат аммония разлагается на аммиак и углекислый газ, которые рассеиваются в растворах хлорида кальция, что приводит к образованию кристаллов карбоната кальция. После инкубации, открыть крышку тщательно внутри капота дыма, и использовать петлю, чтобы удалить кристаллы, образоваваемые на водно-воздушном интерфейсе. Используйте пинцет для передачи стеклянных кусочков в стакан, содержащий двойную дистиллированную воду для короткого погружения.
Затем удалите образцы из стакана и используйте двустороннюю ленту, чтобы зафиксировать кусочки стекла на дне чашки Петри. Сухая чрезмерная вода, касаясь границ горки, салфетками. Обложка Чашку Петри, и поместите его в desiccator в течение 24 часов.
Наблюдайте за кристаллами, образоваваемыми на стеклянных кусках с вертикальным оптическим микроскопом при увеличении в 10-40 раз. Наблюдаемые ромбохеграальные кристаллы, скорее всего, кальцит. Если в дополнение к ромбохедеральным кристаллам, раствор содержит сферические кристаллы, которые, скорее всего, являются ватеритными, повторите протокол кристаллизации, убедившись, что шаг очистки выполнен правильно.
Кроме того, убедитесь, что нет карбоната аммония в областях пластины, кроме выделенных скважин. Оптимальная концентрация хлорида кальция определяется по образцу, богатому гладкими гранеными кристаллами кальцита без кристаллов ватерита. Для начала очистите стеклянные горки и стеклянную посуду, как это было сделано ранее.
В дымовой капот поместите карбонатный порошок аммония в углах пластины из 96 колодец. В каждом хорошо, где осадки будут происходить, место стеклянный кусок, который был вырезан и очищен. Подготовь контрольные скважины.
В две контрольные скважины пипетки 90 микролитров 25 миллимолярный буфер Tris при рН 8, дополненный 100 миллимолярный хлорид натрия. Затем добавьте 10 микролитров раствора хлорида хлорида 0,5 млара. Затем отрегулируйте концентрацию аддитивного белка TapA до 10 микромолейных Тапа, 100 миллимоляров хлорида натрия и 25 миллимоляров tris буфера при рН 8.
Приготовьте добавку, содержащую скважины, добавив 90 микролитров аддитивного раствора. Добавьте 10 микролитров раствора хлорида хлорида толарового кальция в добавку, содержащую скважины, чтобы достичь оптимальной концентрации при 50 миллимолярновом хлориде кальция, определяемом ранее. Подготовка пластины с отверстиями на крышке над скважинами, содержащими карбонат аммония, и инкубировать при 18 градусов по Цельсию, как это было сделано ранее.
После инкубации, подготовить стеклянные кусочки в чашку Петри, как это было сделано раньше, и поместить блюдо в desiccator в течение 24 часов. Для количественной оценки процентной массы добавок в карбонате кальция осаждает, сначала проверить коэффициент вымирания добавки используется. Затем используйте микробаланс для взвешивания стеклянных кусочков, где образовались кристаллы.
После этого соскребли кристаллы со стакана в эппсовую трубку с 1,2 миллилитров раствора 0,1 молярной уксусной кислоты. Vortex кратко, а затем поместить трубку в sonicator для sonicate образца, пока кристаллы исчезают. Храните образец при комнатной температуре в течение 24 часов.
Взвесьте стеклянную горку после соскабливания кристаллов. Измерьте уф-абсорбанс А 1,2 миллилитрового звукового раствора на 280 нанометров для белковой добавки. Используйте уравнение Пиво-Ламберт для расчета его концентрации c.
L - это оптический путь внутри кюветта. Для расчета массы добавок в кристалле, используйте уравнение, c раз v равно м, если концентрация в миллиграммах на миллилитр. Если концентрация находится в родинки на литр, а затем рассчитать родинки применения c раз v равно.
Затем используйте молекулярный вес для расчета массы добавок. Рассчитайте процент веса добавок в кристаллах. M является масса добавок, и дельта м с, является масса кристаллов карбоната кальция, которые были соскребли стеклянный кусок.
Sem изображения показывают сравнение между надлежащего контроля с гладкими кальцитом лица, и кальцит кристаллы с лицами, состоящими из шагов. Сферические кристаллы - ватерит. Успешные и неудачные контрольные эксперименты привели к раманской спектроскопии, показывающей типичные спектры кальцита и ватерита соответственно.
Раскол Раманой смены на уровне около 1080 процентов является наиболее очевидной характеристикой ватерита. Кристаллы карбоната кальция, образоваваемые в присутствии Тапа, отличаются от контрольных кристаллов. Образовалась сложная сферическая карбонатная сборка кальция, состоящая из нескольких кальцитных микрокристалл.
Рамановый спектр кристаллов, образоваваемых в присутствии Тапа, похож на спектр кальцита. Абсорбентные спектры TapA, и контроль без добавки, были измерены после растворения кристаллов в кислоте. Масса процентов TapA было определено, чтобы быть 1,8 плюс или минус 0,2% Очень важно внимательно следить за очисткой шаги, и чтобы убедиться, что стандарты контроля будут выполнены до тестирования добавок'влияние на формирование карбоната кальция.
Кроме того, важно удалить излишки карбоната аммония в порошкообразном виде из скважин. Карбонат аммония разлагается на аммиак и углекислый газ. Аммиак является токсичным при вдыхании, и, следовательно, карбонат аммония должны быть обработаны внутри дыма капот только.
Для того, чтобы оценить внутреннюю морфологию и структуру кристаллов, вы можете разделить их с помощью сфокусированного ионового луча, изображение секций с электронным микроскопом передачи, и измерить модели дифракции электрона из определенных мест вдоль секций. Этот метод ранее использовался для изучения влияния различных молекул на морфологию и структуру карбоната кальция. Мы разработали этот метод для биополимеров, которые производятся бактериальными клетками в биопленки.
Будет интересно провести дополнительные исследования с другими биополимами производства различных бактериальных штаммов.
