我々のプロトコルは、単離分子が炭酸カルシウムの形態および構造に及ぼす影響を研究するための、単純なin vitroシステムを記述する。この技術は、I試験する生体分子が高価である場合、または少量で入手可能である場合、ならびに遅い炭酸カルシウム沈殿が必要な場合に有利である。さらに、同じ条件下で複数の沈殿実験を一度にプローブすることができます。
まず、制御実験を準備する。ガラス片やガラス製品を洗浄するために、三重蒸留水とエタノールを使用してください。ダイヤモンドペンを使用して、96ウェルプレートのウェルに収まるように、ガラス顕微鏡スライドの破片をカットします。
ガラスの場所を三重蒸留水でビーカーに入れ、水がガラススライドを覆う。10分間バスソニケーターでソニッケート。水をデカントします。
ガラススライドを覆うためにエタノールを追加し、10分間バスソニケーターで再び超音波処理します。次に、スライドとガラス製品を窒素ガスの流れで乾燥させ、130ワットで10分間空気プラズマクリーナーに入れます。ヒュームフードで、96ウェルプレートの角にある井戸に炭酸アンモニウム粉末を充填し、アルミホイルを使用してプレートを密封します。
箔をパラフィンフィルムで覆います。窒素ガスを使用して残った炭酸アンモニウムを洗浄してください。以前にカットして洗浄したガラス片を、中央に最も近い5つの異なる井戸に入れます。
10、20、30、40、および50ミリモル濃度の増加勾配で三重蒸留水で調製された塩化カルシウム溶液の100マイクロリットルでガラス片を持つ各井戸を充填します。次に、炭酸アンモニウムを含む各ウェルのカバーを針で3回穿刺する。蓋を戻し、パラフィンフィルムで国境を密封し、20時間保育器で摂氏18度に保ちます。
インキュベーション中、炭酸アンモニウムはアンモニアと二酸化炭素に分解され、塩化カルシウム溶液に拡散し、炭酸カルシウム結晶が形成されます。インキュベーション後、蓋を慎重に煙のフードの内側に開け、ループを使用して水と空気の界面で形成された結晶を取り除きます。ピンセットを使用して、ガラス片を二重蒸留水を含むビーカーに移し、短いディップを行います。
次に、ビーカーからサンプルを取り出し、両面テープを使用してガラス片をペトリ皿の底に固定します。乾燥した余分な水は、ティッシュワイプで、スライドの境界に触れる。ペトリ皿を覆い、デシケータに24時間置きます。
ガラス片に形成された結晶を、10~40倍の倍率で直立光学顕微鏡で観察します。観察された菱形結晶は、最も可能性の高い方解石である。菱形結晶に加えて、溶液にバテライトである可能性が最も高い球状の結晶が含まれている場合は、結晶化プロトコルを繰り返し、洗浄ステップが正しく実行されていることを確認します。
また、専用のウェル以外のプレートの領域に炭酸アンモニウムがないことを確認してください。塩化カルシウムの最適濃度は、バテライト結晶のない滑らかなファセットカルサイト結晶を豊富に含むサンプルに従って決定されます。まず、以前のようにガラススライドとガラス製品をきれいにしてください。
ヒュームフードに炭酸アンモニウムパウダーを96ウェルプレートの角に置きます。降水が発生する各井戸に、カットされ、洗浄されたガラス片を配置します。コントロールウェルを準備します。
2つの対照ウェルに、ピペット90マイクロリットルの25ミリモルトリスバッファーをpH8で、100ミリモル塩化ナトリウムを補う。その後、0.5モル塩化カルシウムストック溶液の10マイクロリットルを加えます。次に、添加タンパク質TapAの濃度を10ミクロモルTapA、100ミリモル塩化ナトリウム、および25ミリモルトリスバッファーpH8に調整します。
添加液を90マイクロリットル添加して、ウェルを含む添加物を調製します。10マイクロリットルの0.5モル塩化カルシウムストック溶液を含む添加物に添加物に加え、以前に決定した50ミリモルの塩化カルシウムで最適濃度に達します。炭酸アンモニウムを含む井戸の上にカバーに穴を開けてプレートを準備し、以前に行われたように摂氏18度でインキュベートします。
インキュベーション後、前に行われたようにペトリ皿にガラス片を準備し、24時間乾燥機に皿を置きます。炭酸カルシウム沈殿物中の添加剤の質量割合を定量化するために、まず使用する添加剤の消毒係数を確認する。次に、マイクロバランスを使用して、結晶が形成されたガラス片の重量を量る。
その後、ガラスから0.1モル酢酸溶液の1.2ミリリットルのエッペチューブに結晶を削り取ります。渦を短時間、その後、結晶が消えるまでサンプルを超音波処理するために超音波処理器にチューブを配置します。試料を室温で24時間保存します。
結晶を削り取った後、ガラススライドの重量を量ります。タンパク質添加剤用の280ナノメートルで1.2ミリリットル超音波処理溶液のUV吸光度Aを測定します。ビール-ランバート方程式を使用して、その濃度cを計算します。
Lはキュベット内部の光路である。結晶中の添加剤の質量を計算するには、濃度がミリリットル当たりミリグラムである場合、c回vはmに等しい式を使用する。濃度が1リットル当たりのモルである場合、c倍vがnに等しいモルを計算する。
その後、分子量を使用して添加剤の質量を計算します。結晶中の添加剤の重量パーセントを計算します。Mは添加剤の質量であり、デルタmsと、ガラス片から削り取った炭酸カルシウム結晶の質量である。
SEM 画像は、滑らかな方解体の面を使用した適切なコントロールと、ステップで構成される面を持つ方解石結晶の比較を示しています。球形の結晶はバテライトです。成功した対照実験と成功した制御実験は、ラマン分光法をもたらし、それぞれ解石とバテライトの典型的なスペクトルを示した。
約1080センチメートルでラマンシフトの分割は、バテライトの最も明白な特徴です。TapAの存在下で形成される炭酸カルシウムの結晶は、対照結晶とは異なる。複雑な球状炭酸カルシウムアセンブリ体を、複数の方解石マイクロ結晶から構成して形成した。
TapAの存在下で形成される結晶のラマンスペクトルは、方解石のスペクトルに類似している。TapAの吸収性スペクトルを、添加剤を含まない制御と、酸中の結晶の溶解後に測定した。TapAの質量パーセントは1.8プラスマイナス0.2%であると判断された洗浄工程に注意深く従い、炭酸カルシウムの形成に対する添加剤の効果をテストする前に、制御基準が満たされていることを確認することが重要です。
さらに、粉末状の炭酸アンモニウムをウェルから除去することが重要です。炭酸アンモニウムはアンモニアと二酸化炭素に分解します。アンモニアは吸入すると有毒であり、したがって、炭酸アンモニウムはヒュームフードの中でのみ処理する必要があります。
結晶の内部形態や構造を評価するために、焦点を合わせたイオンビームを使用して断面し、透過型電子顕微鏡で断面を画像化し、断面に沿って特定の場所から電子回折のパターンを測定することができます。この技術は、これまで、炭酸カルシウムの形態および構造に対する様々な分子の影響を研究するために使用されてきた。この方法を、バイオフィルムで細菌細胞によって生成されるバイオポリマーに詳しく説明しました。
異なる細菌株によって生成される他のバイオポリマーとの追加の研究を行うことが興味深いでしょう。
