A angiogênese desempenha um papel importante na metástase e progressão tumoral. Neste protocolo, usaremos o método de imagem de bioluminescência dupla para monitorar a progressão dinâmica do tumor e a angiogênese em um modelo de camundongos de câncer de mama. Neste modelo, podemos acompanhar o crescimento do tumor e a angiogênese simultaneamente no camundongo único através da luciferase Firefly e da imagem luciferase de Renilla, respectivamente.
Este modelo pode ser amplamente aplicado em pesquisa de antitumor drug e oncologia. Este modelo de bioluminescência dupla pode ser usado para rastrear a progressão e a regressão do tumor e para detectar processos moleculares relacionados ao tumor em resposta a estratégias terapêuticas. Angiogênese é um processo crucial de progressão do tumor.
Portanto, o monitoramento da progressão do tumor e da angiogênese de forma visual e sensível é necessário para o desenvolvimento de tratamentos tumorais eficazes. Os procedimentos serão demonstrados por Kaiyue Zhang, Chen Wang e Shang Chen, estudantes do nosso laboratório. Para embalagem de lentivírus e sementes de produção uma vez 10 a 10 a o sexto de células 293T em dois mililitros de DMEM suplementados com soro bovino 10% fetal por poço em uma placa de seis poços para cultura noturna em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.
Na manhã seguinte misture 7,5 microliters de liposesom com 250 microliters de Minimal Essential Medium em dois tubos separados de 1,5 mililitro para uma incubação de cinco minutos à temperatura ambiente. Para preparar as soluções de DNA adicione o vetor plasmídeo lentivírus RR e plasmídeos auxiliares a 250 microliters de Minimal Essential Medium em tubos individuais de 1,5 mililitros conforme descrito na tabela. No final da incubação adicione suavemente as soluções de DNA RR às suspensões lipossóias de forma em termos de gota e permita que o DNA se conecte às membranas lipídicas por 20 minutos à temperatura ambiente.
Enquanto a mistura está incubando, substitua o supernascedor da cultura celular 293T por um mililitro de cultura fresca, e adicione suavemente 0,5 mililitros da mistura de DNA lipossome apropriada a cada poço. Devolva as células à incubadora de cultura celular por 12 a 16 horas antes de substituir o supernacido em cada poço por um mililitro de cultura fresca complementada com antibióticos. Após mais 36 horas de incubação, acumule os supernacantes em um tubo cônico por cepa de lentivírus para sedimentar as células 293T por centrifugação.
Em seguida, transfira os supernantes contendo RR de lentivírus em tubos de armazenamento de polipropileno estéril de 1,5 mililitro para armazenamento a menos 80 graus Celsius. Para transdução lentiviral para expressão genética em células tumorais mamárias 4T1, substitua o supernante em cada poço de uma placa de cultura celular 4T1 de seis poços por um mililitro de cultura celular fresca baseada em RPMI complementada com soro bovino fetal e um mililitro de estoque lentiviral. Em seguida, adicione oito microgramas por mililitro de Polybrene a cada poço, e delicadamente pipeta algumas vezes para misturar.
Centrifugar a placa para ajudar a aumentar a eficiência da transdução, e devolver as células à incubadora de cultura celular por quatro a 12 horas. No final da incubação, substitua o supernascer em cada poço por meio de cultura fresca suplementado com soro e antibióticos para remover quaisquer partículas lentivirais e Polybrene. Para selecionar para as células transduzidas pelo lentivírus, transde as culturas celulares 4T1 transduzidas em uma proporção de um para três para um para quatro com o meio de seleção, alterando o meio a cada dois ou três dias.
Após sete dias de seleção de cultura média, veja as culturas celulares transduzidas sob um microscópio de contraste de fase invertida de fluorescência e conte o número de células fluorescentes fluorescentes vermelhas ou RFP-4T1 e todas as células 4T1 em três campos de visão para estimar a razão RFP-positivo. Para configurar um modelo de camundongo portador de tumor, lave 80% de culturas celulares transduzidas com PBS antes de destacar as células com dois mililitros de trippsina-EDTA por placa de cultura de 60 milímetros. Quando as células tiverem levantado dos fundos da placa, pare a reação com cinco a 10 mililitros de soro suplementado médio por placa.
E transfira as culturas para tubos de centrífugas individuais de 15 mililitros para contar. Diluir as células para uma única vezes 10 a sexta células por 100 microliters de meio de cultura sem concentração de soro. E injete subcutâneamente 100 microlitadores da linha celular 4T1-RR no ombro esquerdo de um rato modelo de tumor anestesiado, e 100 microliters da linha de células 4T1-RRT no ombro direito do mesmo mouse.
Após as injeções, coloque cada rato em uma área de recuperação apropriada com um suporte térmico até que esteja totalmente recuperado. Palpar as massas tumorais todos os dias durante sete dias para confirmar que os camundongos são portadores de tumores. No sétimo dia pós-implantação, injete intraperitoneally 50 microgramas por quilograma de Ganciclovir em cada rato portador de tumor duas vezes por dia até o final do experimento.
Para o crescimento do tumor, abra o Sistema de Imagem Viva. Inicialize o software Living Imaging e inicialize o sistema. Enquanto o sistema está inicializando, use uma seringa de insulina para injetar cada rato para ser imageado com o volume apropriado de coelenterazina na barra retrobulina.
Coloque os ratos injetados na câmara da câmera e obtenha imediatamente várias fotos do rato dorsalmente para adquirir os sinais de luciferase renilla de células 4T1 até que os sinais bioluminescentes desapareçam. 10 minutos após a imagem da luciferase renilla, use uma seringa de insulina para injetar intraperitonealmente o volume apropriado de D-luciferina em cada animal. 10 minutos após a injeção de D-luciferin, coloque os ratos na câmara da câmera e obtenha várias imagens do rato dorsal para adquirir os sinais de luciferase firefly da angiogênese.
Após a transdução de lentivírus, mais de 99% das células são RFP-positivos, sem diferenças na morfologia da cultura celular observada entre as duas linhas celulares transduzidas. Posteriormente, a imagem de bioluminescência das células transduzidas revela que ambas as linhas celulares emitem fortes sinais bioluminescentes de uma força semelhante. Após a injeção subcutânea das linhas celulares transduzidas em um modelo de camundongos com tumor transgênico, o crescimento do tumor induzido pela angiogênese pode ser avaliado por sinais de luciferase firefly na presença de D-luciferina no mesmo animal.
Aos sete dias após a implantação, a administração ganciclovir induz a morte nas células 4T1-RRT, resultando em uma redução dramática do sinal de luciferase renilla nos tumores estabelecidos por essas células. Os sinais de luciferase de vagalume também aumentam em conjunto com o aumento da expressão da luciferase renilla e diminuem após o declínio da luciferase. Juntos, esses resultados sugerem que há uma correlação direta entre angiogênese tumoral e crescimento tumoral.
De fato, a morte celular tumoral induzida por Ganciclovir pode levar a uma inibição da angiogênese tumoral. Além disso, a imunosmunagem para o receptor de fator de crescimento endotelial anti-vascular II, como um marcador de angiogênese, revela uma estrutura microvascular mais significativamente estabelecida em seções de tecido tumoral 4T1-RR do que em seções de tumores 4T1-RRT, consistente com o declínio do sinal de luciferase firefly observado após a administração de Ganciclovir. A etapa mais crítica do protocolo é usar dois tipos de luciferase, como FLuc e RLuc para rastreamento simultâneo das células e da angiogênese.
Essa tecnologia pode ser usada para tratar células cancerígenas em diferentes locais, e pode ser amplamente usada em modelos de câncer de vírus. Este modelo de camundongos permite que o crescimento do tumor e os efeitos anti-tumores do sistema de rastreamento HSV-ttk/GCV sejam visualizados dinamicamente em um animal vivo. Uma instalação de nível II de biossegurança é necessária para evitar uma transfecção de lentivírus, já que a mídia contém partículas de lentivírus que podem ser prejudiciais aos seres humanos.
