肿瘤相关巨噬细胞在肿瘤微环境中起着重要的作用。了解肿瘤细胞中不同的基因突变如何影响巨噬细胞的招募，对于为癌症患者设计个性化治疗至关重要。此检测提供了一种简单而稳健的方法，用于评估肿瘤细胞和巨噬细胞在体外之间的相互作用。
这种测定可以修改，以评估肿瘤细胞和其他免疫细胞在体外之间的相互作用。要开始这个程序，将无血清干细胞培养素放入37摄氏度的水浴中加热20分钟。用 70% 乙醇喷洒组织培养罩表面，然后用纸巾擦拭喷涂表面。
接下来用70%乙醇喷洒介质和细胞分离溶液瓶，然后用纸巾擦拭。将清洁的瓶子转移到组织培养罩中。取回肿瘤细胞并转移到组织培养罩中。
吸气介质，用10毫升PBS清洗细胞。然后向烧瓶中加入两毫升的细胞分离溶液。将烧瓶放下引擎盖，每分钟检查一下肿瘤细胞是否四舍五入。
一旦肿瘤细胞四舍五入，轻轻敲击烧瓶的侧面，帮助细胞分离。在此之后，移液器8毫升的无血清细胞培养成烧瓶和移液器上下三次混合。将电池悬浮液转移到15毫升离心管，在200倍g和4摄氏度下将离心机转移到5分钟。
吸上一道。然后用10毫升PBS洗涤细胞，确保上下移液三到五次混合。将细胞在200倍g和4摄氏度下离心5分钟。
吸上一提液，并在10毫升无血清介质中重新释放细胞。上下移位三到五次混合。将此电池悬浮液的 10 微升与 10 微升的 Trypan Blue 溶液混合。
接下来移液器10微升的 Trypan Blue 和细胞混合物进入计数幻灯片，并使用自动细胞计数器量化活细胞数。使用无血清细胞培养将细胞密度调整为每毫升的5个细胞的2.5倍10。然后将两毫升的细胞播种到六井培养板的每个井中。
同时，准备六口只用两毫升无血清干细胞培养的井。在此之后，在37摄氏度下孵育6孔板，用5%的二氧化碳孵育24小时。首先用70%乙醇喷洒组织培养罩表面，然后用纸巾擦拭喷涂表面。
接下来用70%乙醇喷洒介质和细胞分离溶液瓶，然后用纸巾擦拭。将清洁的瓶子转移到组织培养罩中。在此之后，从培养箱中取回六孔板。
小心地将调节介质移液到 15 毫升无菌离心管中，然后将管放在冰上。将0.5毫升的细胞分离溶液加入六孔板的每个孔中，并每分钟检查肿瘤细胞是否四舍五入。一旦肿瘤细胞四舍五入，轻轻敲击板的一侧，以帮助分离细胞。
接下来移液器2.5毫升的肿瘤细胞维持介质进入井和移液器上下三次混合。将细胞转移到15毫升无菌离心管中。将10微升的细胞与10微升的 Trypan Blue 溶液混合，将10微升的混合物转移到计数幻灯片中。
使用自动细胞计数器量化活细胞的数量，并使用在37摄氏度下孵育的无血清干细胞培养所，根据细胞数量调整条件介质的体积。通过 0.45 微米过滤器过滤调节介质，将调节介质放在冰上。首先，在37摄氏度的水浴中预热 IMDM 介质20分钟。
用 70% 乙醇清洁组织培养罩，并清洁介质瓶，然后如前所述将其运输到护罩中。接下来将 MV-4-11 细胞的烧瓶转移到发动机罩中。将10毫升细胞移入15毫升离心管。
使用 Trypan Blue 和自动单元格计数器来量化前面描述的活细胞数量。然后在200倍g和4摄氏度下将细胞离心5分钟。吸上一液，用10毫升PBS清洗细胞。
在200倍g和4摄氏度下再次离心5分钟。吸升液，以每毫升一百万个细胞的最终细胞密度重新暂停 IMDM 培养中的细胞。首先将必要的材料带到室温。
在每个刀片中添加 250 微升准备好的 MV-4-11 电池。接下来，在24井板的下腔中只添加400微升的调节介质或介质，确保将样品加入三升。在37摄氏度下孵育，用5%的二氧化碳孵育4小时。
然后轻轻敲击同一井内壁上的刀片，然后丢弃刀片。轻轻移液孔中的细胞上下三次混合。将该电池悬浮液的 225 微升转移到适用于荧光测量的黑壁 96 孔板的孔中。
在此之后，用4x解液缓冲液稀释CyQUANT染料，比例为1比75。短暂涡流并旋转溶液。将该溶液的75微升转移到96井板的每个井中，并在室温下孵育15分钟。
使用荧光板读取器，读取荧光并分析文本协议中概述的数据。在这项研究中，体外测定用于研究肿瘤巨噬细胞的相互作用。荧光值高的样本表明，条件介质具有高容量来招募巨噬细胞。
根据实验需要，可以包括额外的控制。例如，可以使用中和抗体来治疗条件介质，以废除巨噬细胞化疗，并执行相同的方式。人们还可以向条件介质添加额外的化疗素，作为一个积极的控制。
控制此测定的细胞数差异非常重要，因为不同的细胞类型可以以不同的速度增长。体外结果的体内确认至关重要。一个人可以注射肿瘤细胞到小鼠和分析肿瘤与流动细胞学，免疫污染和CyTOF，以确认结果。
