该协议是重要的，因为它允许用户生成一个基因组表达系统，可以经历替代拼接，在这种情况下，形成循环RNA，可以测试其功能和疾病关联。该技术的主要优点是，在研究圆形RNA形成和功能的替代拼接时，它将为其他人在分子生物学和克隆中使用这一协议铺平道路。我给第一次尝试这种技术的人的建议是优化PCR条件。
运行梯度或执行接触PCR与不同的退火温度和延长时间。通常，超过 6 KB 的较长片段将延长每个周期 1 KB，需要测试不同的退火温度以获得最佳放大。此方法的演示至关重要，因为它将为用户提供更好的可视化表示过程中比较困难的方面，尤其是底像的生成。
要开始此过程，请加载 UCSC 基因组浏览器，并用它来识别循环 RNA 形成所需的重复元素，并将其合并到构造中。重要的是，用于放大的底剂需要位于重复元素之外。将圆形RNA序列粘贴到人类BLAT搜索中，并选择合适的生物体。
提交序列，转到浏览器视图，并缩小 1.5 计时器或酌情。接下来，将鼠标悬停在重复元素上，以在浮动窗口中标识其子类型。阿卢元素在正弦线中。
如果获取不正确的图像，请使用窗口下的默认轨道按钮重置浏览器。首先去查看，在USS基因组浏览器的顶部行的DNA下载窗口中显示的DNA序列。在排序格式选项中，选择扩展大小写/颜色选项。
选择默认大小写为较低，然后为 NCBI RefSeq 选择切换大小写。为重复掩应选择下划线和粗体以及"一元"的"形体"。单击"提交"。
将有外文作为大写字母和内文作为小写字母。检查 exon/intron 边框。如果浏览器显示反向补码，请返回并选择反向补码框，直到显示正确的 exon/intron 边框。
接下来，将具有正确方向的文件复制到文字处理文档中并突出显示 exons。选择要放大的片段，确保内子不会以重复区域开始或结束，因为这些区域中的底因不会放大特定序列。首先，使用 Web 工具设计克隆的底项。
对于向量序列，将插入位点添加为最后一个核苷酸，然后添加片段。由于矢量编号不是从给定的插入站点开始，因此向量中插入的站点位于，下游部分位于上游序列的前面。如果其熔点相距超过 4 摄氏度且在放大中不起作用，请调整底向器。
在这项研究中，克隆并分析了产生循环RNA的记者基因。优化的 PCR 产品在含有 1X 凝胶的绿色 1% agarose 凝胶上分离。单个频段表示将用于酶DNA组装的PCR产品。
然后从凝胶中切出这些带子并进行纯化。纯化的 PCR 产品没有达到预期尺寸，使用凝胶绿色，因此产品也分离在 1%的 agarose 凝胶上，随后沾染溴化乙二苯胺，以确保产品尺寸正确。首先，设置一个酶DNA组装套件。
以一比二的摩尔比例合并矢量和插入。接下来，添加10微升的DNA组装主混合物。在50度下孵育样品60分钟。
在孵育过程中在冰上解冻称职的细胞。电池的体积应为 50 微升。接下来，使用总组装反应转换称职的细胞。
将冷冻组装产品的两微升添加到主管单元中。轻轻轻拂管子四到五次。不要漩涡。
将混合物放在冰上30分钟。热在42摄氏度下冲击混合物30秒。然后把它放回冰上两分钟。
在此之后，向管中加入950微升室温S、C介质。在37摄氏度下孵育60分钟，在300 RPM下摇晃。在此孵育过程中，加热两个含有适当抗生素的选择板。
孵育后，将反应管在10，000克离心30秒，将细胞进行颗粒化，并在一个选择板上取出25%的细胞，将75%的细胞板化。在37摄氏度下孵育这些板块过夜。在你开始转染之前，通过限制消化检查你的DNA。
在这里，一个代表性的tau微基因，包含外子9至12被削减与限制酶指示，以排除主要重组。对于转染，首先以pH2浓度每毫升1毫克的速度将线性聚乙烯盐酸溶解在水中。使用氢氧化钠使 pH 值高达 7，并使用 0.22 微米过滤器将溶液无菌过滤。
将溶液存放在摄氏四度，直到准备好使用。然后将细胞分成六孔板的井中，让它们在含有10%FBS的DMEM介质中过夜生长。第二天，在无菌管中加入一微克报告的基因，并加入200微升的无菌过滤150毫摩尔氯化钠。
通过漩涡混合。接下来，将聚乙二烯胺溶液加入到这种混合物中，每一微克DNA，聚乙二烯胺的比例为三微升。短暂离心，收集管底的样品。
在室温下孵育样品10分钟。然后直接将其添加到 HEK293 细胞中。用5%的二氧化碳在37摄氏度下孵育细胞过夜。
第二天，使用RNA隔离试剂盒分离RT-PCR的RNA。从来自人类脑组织的两个样本中提取的cDNA被放大与圆形RNA底色环tau exon 1210反向和圆tau exon 1211前进。虽然与tau圆形RNA对应的预期波段被看到，但其他强频段是与人类基因组不匹配的神器。
本实验在相同的PCR条件下重复，但逆转录只能用圆头1210反向底因进行。只有预期的波段通过测序被放大和验证。然后使用RNARSe R进行治疗，去除线性RNA。
循环RNA在治疗后可检测，而线性RNA则不再提供可检测信号。RNA在转染后24小时被分离，并由RT-PCR进行分析。线性 tau mRNA 的放大显示了两个波段，由于 exon 10 的替代拼接。
它们的比例与拼接因子的过表情变化有关。圆形1210 tau RNA的扩增显示了tau圆RNA表达对一些拼接因子，特别是Cdc2样激酶CLK2和SR蛋白9G8的表达的依赖性。尝试此过程时，要记住的最重要的事情是构造微基因时底向器的设计和位置。
底像不应位于重复元素中，需要根据被放大的片段在不同条件下进行优化。按照此过程，可以执行的其他方法将测试循环 RNA 的功能。用户可以测试蛋白质的转化或封存，以确定用户感兴趣的特定圆形RNA的功能。
这项技术为利用微基因系统中的基因组片段铺平了道路，这种片段可以过度表达循环RNA，允许用户测试和识别其功能，并在某些方面与疾病关联。这项技术的含义延伸到特定疾病的潜在疗法和诊断，例如与tau病理学相关的神经退行性疾病。我们发现，微管相关蛋白tau，称为 MAPT，产生圆形RNA，我们相信，这是有助于疾病病理学和这种方法使我们能够充分研究这些循环RNA，并确定其功能和与疾病的关系。
这种方法可以深入了解循环RNA，它们的功能是什么，以及它们在某些疾病中可能发挥的作用。此方法可用于克隆其他微型基因，这些小基因可以跨物种表达循环RNA，以便深入了解其功能。PCR产品的扩增被证明是最困难的，从基因组DNA中扩增的长片段，以及片段中具有多个重复元素。
