该协议演示了如何使用 TOF 显微镜的实时成像来研究细胞分泌，并提供用于检测聚类事件或高活性区域的工具。使用此协议，我们可以在微模式表面上生成细胞培养，使细胞分裂正常化，从而促进分泌事件的特殊范围。细胞分泌各种大分子，在免疫调节中起重要的作用。
在癌症中，解除调节的分泌会影响蛋白糖解酶的释放，从而促进入侵。分泌物的量化将使我们能够更好地了解癌症中的降解分泌物和其他动态过程，如抗原表达。尽管我们的成像和分析协议非常简单，但它需要生成在微模式上广泛传播的单个细胞。
在这段视频中，我们将演示如何在微模式盖玻片上培养细胞，以及如何使用空间统计工具可视化和分析分泌事件。为准备微表光的盖玻片，在深紫外光下激活乙醇消毒直径为25毫米的玻璃盖玻片5分钟。在激活盖玻片时，在湿润室内的一块石蜡薄膜上加入一滴 30 微升聚硅氨酸嫁接聚乙烯二甘醇。
在激活结束时，将活化表面侧的盖玻片向下放置到落液上，并覆盖湿润室，在室温下孵育一小时。在孵育结束时，用蒸馏水清洗盖玻片两次。当盖玻片干燥时，用蒸馏水清洗石英光面膜一次，用酒精洗涤一次。
用过滤的气流干燥照片面罩，将照片面罩镀铬侧暴露在深紫外线下五分钟。在照明结束时，将一滴 10 微升水添加到每个照片面罩的镀铬侧，并将每个盖玻片的聚乙烯二醇侧放在每滴水上。去除多余的水后，在滑梯上放置薄膜盖，以避免脱水。
将照片蒙版的非镀铬涂层面暴露在深紫外线下五分钟，然后向照片蒙版添加多余的水以去除盖玻片。此步骤将在表面上产生微模式印记。然后在潮湿腔室的石蜡膜上，在石蜡膜上孵育盖玻片，在层流罩下孵育一小时。
对于细胞播种到准备好的微表图表面，在孵化结束时，将盖玻片放在磁性盖玻片架微表板侧向上，并立即在盖玻片中添加图案介质。添加密封件后，使用磁性设备固定盖玻片，然后用附加图案介质填充盖玻片支架。然后用玻璃盖合上支架。
当细胞准备就绪时，将5倍10添加到第5个转染不朽视网膜色素上皮细胞到盖玻片中，并在细胞培养箱中孵育支架中的细胞10分钟。在孵育结束时，使用一个移液器吸吸旧介质，同时使用第二个移液器每次洗涤用新鲜介质清洗细胞五次，以去除非附着细胞和任何残留的胎儿牛血清。最后一次洗涤后，将支架返回孵化器三小时，以允许全细胞扩散。
要成像外细胞增多事件，请将盖玻片支架置于总内部反射荧光显微镜下，并搜索表达 VAMP7-pHluorin 完全传播的细胞。改变激光的角度，直到达到总的内部反射荧光角度，允许VAMP7-pHluorin外细胞病事件的可视化，并在与外细胞病率和时间刻度兼容的频率下执行五分钟的采集。为了获得外细胞增多坐标，打开斐济获得的外细胞增多事件膜，通过向外传播的明亮信号的外观手动识别外细胞增多事件。
使用点工具标记外细胞增多事件的中心，并使用分析和测量来测量 x 和 y 坐标以及时间坐标。将一个单元格的测量值保存在一个文本文件中。在电子表格中打开文本文件，并删除除切片 x 和 y 坐标列的所有内容。
接下来，使用椭圆形工具和测量测量中心和直径，并获取每个单元的 x 和 y 坐标和 Feret 的直径。将所有单元格的测量值保存在一个文本文件中。打开电子表格中的文本文件，并删除除 x 和 y 坐标和 Feret 直径列外的所有内容。
然后添加每个单元的半径测量值，然后从每个单元的 Feret 直径获取半径。使用直线工具测量每个单元的微模式环的厚度。将此测量值保存在一个文本文件中，然后将粘附长度除以单元格半径以计算规范化粘附长度。
对于单个单元空间分析，首先安装 RStudio 的包，然后将包加载到 RStudio 中。使用 ESA 功能运行包。用户界面将打开，然后选择数据集 TXT 文件的目录和输出绘图的目录。
该脚本将自动启动和执行分析，提供包含数值结果的相应绘图和 TXT 文件的 PDF 文件。在细胞内，探针中的地板被异体的低pH值淬火，但在外细胞形成过程中，随着质子释放，pH值增加，pHLOrin开始发出信号。pHluorin 信号在外细胞形成期间表现出峰值，表示利索体质子的快速释放，然后是指数信号衰减，表示等离子体膜上探针的二维扩散。
通常，转染不朽的人类视网膜色素上皮细胞表现出重要的细胞分离活性，平均外细胞形成率为0.28赫兹。通过内核密度估计可以可视化外细胞病的二D分布，以显示局部密度的差异。与完全空间随机性有三种可能的偏差:聚类、分散或聚类和分散的混合。
里普利的 K 函数可用于评估这些偏差。值得注意的是，非粘性区域的外细胞增多事件也聚集在一起，表明粘附分子并不是诱导血浆膜分泌热点的唯一结构。根据代表性细胞的模数绘制外细胞病事件的直方图，可发现粘合剂和非粘合区域之间的边界周围有一个峰值。
成对分析表明，粘附区的表面密度低于非粘附区，可能是由于细胞外围外细胞病的显著减少。将微模式上的细胞粘附与统计分析相结合，有助于精确定位细胞过程（如分泌物）在空间中的调控方式。今后还需要做更多的工作来确定分泌活动聚类的分子机制。
